張丹 李明慧 屈曉晶 靳麗 張璐 路遙 謝堯 劉順愛(ài) 成軍 華文浩 宋淑靜

100015首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心

HBV不同感染狀態(tài)患者CD4+T細(xì)胞功能的差異研究

張丹 李明慧 屈曉晶 靳麗 張璐 路遙 謝堯 劉順愛(ài) 成軍 華文浩 宋淑靜

100015首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院肝病中心

目的 探討適應(yīng)性免疫應(yīng)答（adaptive immune response）中CD4+T淋巴細(xì)胞在不同HBV感染狀態(tài)患者中功能的差異。方法 采集健康成人（hea1thy individua1s，HI）、急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）、慢性HBV感染免疫耐受期（immune to1erance phase，IT）和免疫清除期（immune c1earance phase，IC）患者的外周靜脈全血。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞頻數(shù)，表面功能分子CD69表達(dá)，Th1、Th2亞群細(xì)胞頻數(shù)及Th1/Th2比值，并分析其在HBV感染不同狀態(tài)患者中的差異。結(jié)果 共收集健康人、急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和免疫清除期患者各12、33、30、49例。急乙肝組CD4+T細(xì)胞頻數(shù)（AHB，39.99±8.00%）顯著高于免疫耐受組（IT，33.86 ±6.87%）和免疫清除組（IC，34.52±9.17%）（F=4.584，P=0.004），其余各組差異無(wú)顯著性；急乙肝組的CD69分子的平均熒光強(qiáng)度（mean f1uorescence intensity，MFI）（25.56±9.01）也顯著高于免疫清除組（21.66±3.38）和免疫耐受組（21.57±5.58）（F=3.291，P=0.023），而AHB、IC、IT、HI各組的CD69分子絕對(duì)分子數(shù)（abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）依次降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 15.201，P=0.000）。HBV各感染狀態(tài)的Th2/Th1比值均無(wú)顯著性差異（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）。結(jié)論 急性乙型肝炎患者的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)及細(xì)胞表面活化分子CD69均顯著高于慢性HBV感染組；Th2型應(yīng)答在HBV各感染狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答中均占主導(dǎo)地位。

【主題詞】 肝炎；乙肝病毒；CD4+T淋巴細(xì)胞免疫耐受期；免疫清除期

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Fundation of China（NSFCNO.81071344），Beijing Science and Techno1ogy Commission Major Project（D121100003912001）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）HBV是引起人類慢性肝臟疾病的一個(gè)重要原因，每年約有65萬(wàn)人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌（HCC），我國(guó)肝硬化和HCC患者中，分別有60%和80%是由HBV感染引起［1］。由于機(jī)體遺傳背景、免疫狀況的差異，HBV感染后的臨床轉(zhuǎn)歸也不同。大量研究已經(jīng)證實(shí)肝臟炎癥嚴(yán)重程度及病毒清除與特異性細(xì)胞毒性 T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T 1ymphocyte，CTL）有關(guān)［2］，但是對(duì)于輔助型 CD4+T細(xì)胞在臨床發(fā)病和轉(zhuǎn)歸中的作用并不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)不同感染狀態(tài)的HBV感染人群CD4+T細(xì)胞功能進(jìn)行研究，探討其與HBV感染臨床轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。

1 對(duì)象及方法

1.1研究對(duì)象 2014年9月至2016年1月到北京地壇醫(yī)院就診的急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和慢乙肝免疫清除期患者及地壇醫(yī)院健康職工的外周靜脈全血。各組人群入組標(biāo)準(zhǔn)：慢性HBV感染免疫耐受組（IT）：年齡≤38歲，HBVDNA≥107拷貝/m1，HBeAg≥1200 S/CO，ALT≤30 U/L，半年以上未服用過(guò)保肝降酶藥。急乙肝組（AHB）：診斷符合病毒性肝炎防治指南［7］。慢乙肝免疫清除期組（IC）：HBsAg陽(yáng)性6個(gè)月以上，HBVDNA（+），HBeAg≥100 S/CO，ALT≥190 U/L，且至少有3個(gè)月以上的 ALT異常史。所有入組者排除 HIV、HCV、梅毒及其他感染性疾病。該研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2標(biāo)本采集 入組者新鮮EDTA抗凝靜脈全血，4 h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。

1.3主要儀器及試劑 FACSCa1ibur流式細(xì)胞分析儀、熒光標(biāo)記單克隆抗體（鼠抗人CD3-PercP、CD4-APC、CD69-PE、CD4-FITC、CD45RO-APC、CD62LPE）、QuantiBRITE PE微球和紅細(xì)胞裂解液（FACS Lysing So1ution）均購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血CD4+T細(xì)胞分子頻數(shù)及表面分子表達(dá) 細(xì)胞染色后BD FACS Ca1ibur上機(jī)，根據(jù)FSC、SSC設(shè)定淋巴細(xì)胞門(mén)，CD3-PercP （+）CD4-FITC（+）設(shè)定CD4+T細(xì)胞，并劃分Th1 （CD45RO+CD62L-）、Th2（CD45RO+CD62L+）亞群；設(shè)定 CD3-PercP（+）CD4-APC（+）CD69-PE （+）群，并用F1owjo 7.6軟件分析出細(xì)胞頻率、平均熒光強(qiáng)度（Mean f1uorescence intensity，MFI），以QuantiBRITE微球制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平均每個(gè)細(xì)胞表面功能分子 CD69的絕對(duì)分子數(shù)（Abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示。正態(tài)分布資料的四組間數(shù)據(jù)的比較采用方差分析完成，若四組間數(shù)據(jù)比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則采用LSD方法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　入組患者基本信息Tab.1 Genera1 information of subjects in this study（Mean±SD）

表2　各組間CD4+T細(xì)胞亞群的細(xì)胞頻數(shù)及功能分子比較（Mean±SD）Tab.2 The frequency of CD4+T and their surface functiona1 mo1ecu1es in different groups

圖1　CD4+T細(xì)胞頻數(shù)、各亞群頻數(shù)、表面CD69活化分子表達(dá)在健康成人、慢性HBV感染免疫耐受期患者、急性乙型肝炎患者、慢性HBV感染免疫清除期患者中比較Fig.1 Comparison of CD4+T ce11 frequency、the subsets of CD4+T ce11 and the expression of ear1iest activation signa1s CD69 in hea1thy individua1s（HI），patients in the immune to1erance（1T），patients with acute hepatitis B（AHB）and patients in immune c1earance（IC）phase

2 結(jié)果

外周血CD4+T細(xì)胞頻數(shù)，Th1、Th2亞群分布及表面分子CD69、IFNAR2表達(dá)如下：

2.1HBV各感染狀態(tài)臨床指標(biāo)比較 AHB組的ALT顯著高于IC、IT組（F=42.83，P=0.00），而HBVDNA，HBsAg，HBeAg顯著低于IC、IT組（P= 0.00），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

2.2HBV感染各組CD4+T細(xì)胞頻數(shù) 急乙肝組CD4+T細(xì)胞頻數(shù)（AHB，39.99±8.00%）較免疫耐受組（IT，33.86±6.87%）和免疫清除組（IC，34.52 ±9.17%）顯著升高（F=4.584，P=0.004），其余各組無(wú)顯著差異。（圖1，表2）。

2.3Th1、Th2頻數(shù)及Th2/Th1比值 HBV感染各組的Th2細(xì)胞頻數(shù)（F=1.406，P=0.244）和Th2/Th1比值（F=5.464，P=0.01）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Th1顯著高于健康成人組（F=4.469，P= 0.005）（圖1，表2）。

2.4CD4+T細(xì)胞表面表達(dá)的CD69分子的平均熒光強(qiáng)度和絕對(duì)分子計(jì)數(shù) 急乙肝組的 CD69MFI （25.56±9.01）較免疫清除組（21.66±3.38）和免疫耐受組（21.57±5.58）明顯升高（F=3.291，P= 0.023），AHB，IC，IT，HI各組的CD69分子的絕對(duì)分子數(shù)依次降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 15.201，P=0.000）。（圖1，表2）。

3 討論

CD4+T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中主要通過(guò)輔助型T細(xì)胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)，而Th細(xì)胞根據(jù)分泌細(xì)胞因子不同主要分為兩個(gè)亞群（Th1和Th2），其中Th1細(xì)胞主要通過(guò)釋放IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)CTL細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒作用，介導(dǎo)細(xì)胞免疫，有利于自身病毒的清除，而Th2細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL-4、IL-6、IL-10等，表達(dá)協(xié)同刺激分子配體CD40L，結(jié)合B細(xì)胞表面CD40，調(diào)節(jié)體液免疫［3］，與肝臟炎癥損傷有關(guān)。很多研究顯示外周血中Th1/ Th2比例失衡，細(xì)胞免疫紊亂可能是導(dǎo)致HBV感染不能完全恢復(fù)的重要原因［4-5］。CD69是表達(dá)在活化的淋巴細(xì)胞表面的早期活化標(biāo)志，當(dāng)淋巴細(xì)胞受到抗原刺激時(shí)，CD69表達(dá)可上調(diào)，而Luisa Barboza a等的研究顯示慢性HBV感染的患者CD4+T細(xì)胞的早期活化并不充分，體外以HBcAg刺激CD4+T細(xì)胞后表面的活化分子CD69是下調(diào)的，CD4+T細(xì)胞不能完全發(fā)揮作用，也許可以在一定程度上解釋為何病毒在人體內(nèi)持續(xù)存在［6］。

本研究結(jié)果顯示，急性乙型肝炎組的CD4+T細(xì)胞頻數(shù)及細(xì)胞表面的活化分子CD69均顯著高于慢性HBV感染免疫清除和免疫耐受組，提示急性乙型肝炎患者CD4+T細(xì)胞水平的應(yīng)答較慢性HBV感染者明顯增強(qiáng)，同時(shí)顯示不論在慢性HBV感染的免疫清除還是免疫耐受患者，HBV感染均可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的活化和活化分子CD69表達(dá)上調(diào)，這與Luisa Barboza a等的研究是相反的。但其上調(diào)水平有限，在免疫清除期會(huì)引起一定程度的肝臟炎癥，不能達(dá)到與AHB相當(dāng)?shù)母闻K炎癥，HBV感染自然也不能完全恢復(fù)，而免疫耐受期雖然也有CD4+T細(xì)胞應(yīng)答，但可能由于長(zhǎng)期在高載量HBVDNA、HBsAg和HBeAg誘導(dǎo)下，Treg細(xì)胞較急乙肝患者顯著升高，CD4+T細(xì)胞表面抑制性受體（CTLA-4、PD-1等）及抑制性細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β）表達(dá)上調(diào)，使宿主的免疫應(yīng)答整體處于低能水平［7-9］。本研究結(jié)果還顯示，三組HBV感染者Th2/Th1均大于1，AHB與IC組的Th2細(xì)胞頻數(shù)高于IT組和HI組，IT、IC、AHB、HI四組Th1細(xì)胞頻數(shù)呈下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異，可能與有限的入組例數(shù)有關(guān)。其中HI較其余三組明顯下降，提示不論是急性還是慢性HBV感染的炎癥期均以Th2應(yīng)答為主，尤其是急性乙型肝炎早期，Th2分泌大量炎癥因子，攻擊HBV感染肝細(xì)胞從而引起的重度肝損傷，而Th1主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫并不引起轉(zhuǎn)氨酶升高，但其在急性乙型肝炎恢復(fù)期徹底清除病毒中發(fā)揮著重要作用。而慢性HBV感染者雖然也有Th2升高，但由于機(jī)體免疫功能不足，反復(fù)引起肝臟損傷，病毒不能徹底清除，從而使肝炎逐漸向肝硬化發(fā)展。

綜上所述，CD4+T細(xì)胞頻數(shù)和功能的改變?cè)谒拗鞯目共《久庖咧邪l(fā)揮重要作用，Th2應(yīng)答在HBV各感染狀態(tài)的CD4+T細(xì)胞免疫應(yīng)答中占主導(dǎo)地位。通過(guò)對(duì)免疫細(xì)胞的功能進(jìn)行研究為我們?cè)诓煌琀BV感染狀態(tài)選擇合適的治療手段提供了依據(jù)。

［1］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）.中華實(shí)驗(yàn)和臨床感染病雜志：電子版，2015，9：570-589.doi：10.3877/cma.j.issn.1674-1358.2015.05.001.

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CD4+T cell function of the patients in different states of HBV infection

Zhang Dan，Li Minghui，QuXiaojing，Jin Li，Zhang Lu，Lu Yao，Xie Yao，Liu Shunai，Cheng Jun，Hua Wenhao，Song Shujing Liver Center of Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China

Xie Yao，Email：xieyao00120184@sina.com；Liu Shunai，Email：liusa1031@ sina.com

Objective To exp1ore the functiona1 differences of CD4+T 1ymphocytes in patients with different states of HBV infection.Methods Co11ect hea1thy adu1ts（HI），acute vira1 hepatitis（AHB），chronic HBV infection in immune to1erant phase（IT），and chronic hepatitis B in immune c1earance phase （IC）patients with venous b1ood.Use f1ow cytometry to detect periphera1 b1ood CD4+T frequencies，the expression of surface mo1ecu1e CD69，Th1 and Th2 subsets frequency and the ratio of Th1/Th2.and ana1yze the difference in different states of HBV infection.Results Co11ect 12，33，30，49 cases patients of HI，AHB，IT，IC respective1y.The frequency of CD4+T ce11s in the acute hepatitis B group（AHB，39.99± 8.00%）was significant1y higher than that in the immune to1erance group（IT，33.86±6.87%）and the immune c1earance group（IC，34.52±9.17%），（F=4.584，P=0.004），and there was no significant difference among the other groups（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）.Acute hepatitis B group（25.56±9.01）increased significant1y in CD69MFI than in the immune c1earance group（21.66± 3.38）and immune to1erance group（21.57±5.58），In acute hepatitis B，immune c1earance，immune to1erance group and the group of hea1thy adu1ts，the CD69 mo1ecu1ar abso1ute number decreased in turn（F= 15.201，P=0.000）.Conclusions The frequency of CD4+T ce11s and the surface mo1ecu1e CD69 in patients with acute hepatitis B were significant1y higher than those in chronic HBV infection group；Th2 response was dominant in the CD4+T ce11 response to HBV infection.

Hepatitis B；hepatitis B virus；CD4+T 1ymphocytes；immune to1erance phase；immune c1earance phase

國(guó)家自然科學(xué)基金（81071344）北京市科學(xué)技術(shù)委員會(huì)重大項(xiàng)目（D121100003912001）

謝堯，Emai1：xieyao00120184@sina.com；劉順愛(ài)，Emai1：1iusa1031@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.019

2016-03-01）