吳 允，畢榆林，張 揚(yáng)，郭曉敏，李志騰，萬 方，朱鵬飛，徐 璐，常國斌，徐 琪，陳國宏（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

中國部分雞種B-G基因SNP和Indel

吳 允，畢榆林，張 揚(yáng)，郭曉敏，李志騰，萬 方，朱鵬飛，徐 璐，常國斌*，徐 琪，陳國宏
（揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

雞的MHC基因家族中B-G基因與雞抗病性有關(guān)，通過研究與抗病有關(guān)的B-G基因的多態(tài)性可以從根本上提高雞抵抗疾病的能力，進(jìn)而為抗病育種奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)對(duì)25個(gè)雞種基因組DNA進(jìn)行目標(biāo)捕獲測序，以NCBI中Gallus gallus的B-G基因序列為參考，利用MEGA6軟件進(jìn)行不同雞種基因序列比對(duì)，分析B-G基因外顯子和內(nèi)含子中的SNPs和Indels以及氨基酸的變化，最后制作進(jìn)化樹。結(jié)果表明，25個(gè)雞種中外顯子存在8個(gè)SNPs、19個(gè)Indels，內(nèi)含子有67個(gè)SNPs、327個(gè)Indels；同時(shí)氨基酸序列也呈現(xiàn)出相應(yīng)的多態(tài)性，中國地方雞種也表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。來航雞、仙居雞、隱性白羽雞的B-G基因存在豐富的多態(tài)性；來航雞在進(jìn)化樹上單獨(dú)為一類，藏雞、文昌雞由于地理位置因素也分別為單獨(dú)一類；現(xiàn)代肉雞中羅斯與隱性白羽雞聚為一類；不同類型的中國地方雞種間同源性較小。中國地方雞種B-G基因存在多源性進(jìn)化以及豐富的遺傳多樣性，進(jìn)而產(chǎn)生抗病性差異。

雞；B-G基因；SNPs；Indels；進(jìn)化樹

雞的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）基因是在16號(hào)微小染色體上一組緊密連鎖的基因簇［1］，其編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞的自我識(shí)別中有重要作用，并且其參與細(xì)胞免疫和體液免疫［2］。家禽中MHC基因群有2個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，B基因座和Rfp-Y基因座［3］。B基因座由B-F（Ⅰ類）、B-L（Ⅱ類）、B-G［4］（Ⅳ類）基因組成。B-G基因是家禽特有的，該基因家族多數(shù)在紅細(xì)胞、血小板表面表達(dá)，在紅細(xì)胞表面表達(dá)的不僅具有抗原呈遞和抗原識(shí)別的免疫功能，而且對(duì)MHCⅠ類和Ⅱ類抗原的體液免疫應(yīng)答具有輔助作用［5］；有較少的在腸上皮細(xì)胞和白細(xì)胞表面表達(dá)［6］，其功能尚不清楚。我國雞種資源豐富，分布廣泛，經(jīng)歷長期的自然選擇和人工選擇［7］，使得我國的雞有著優(yōu)良的性狀，如：抗逆性強(qiáng)、繁殖率高、肉質(zhì)好等特點(diǎn)。這些優(yōu)良性狀中雞的抗性主要與MHC基因簇相關(guān)，MHC基因家族中關(guān)于B-F、B-L基因的報(bào)道較多，而對(duì)BG基因的多態(tài)性的報(bào)道較少。本次研究旨在以25種雞為試驗(yàn)材料，通過目標(biāo)序列捕獲方法對(duì)B-G基因進(jìn)行SNPs和插入和缺失（Indels）分析，以期能探明該基因的遺傳多樣性，為家禽的抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 雞品種來源及基因組DNA提取

本試驗(yàn)共采集25個(gè)雞品種，其中羅斯雞（LS）、廣西黃雞（GH）、青腳麻雞（QM）、綠殼蛋雞（LD）、太湖雞（TH）、溧陽雞（LYA）、如皋雞（RC）、雪山草雞（XC）、文昌雞（WC）、隱性白羽雞（YB）、來航雞（LH）、安卡雞（AK）等雞種來自揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室禽種資源基因庫；北京油雞（YJ）、蕭山雞（XS）、泰和烏骨雞（WG）、黑狼山雞（HL）、斗雞（DJ）、固始雞（GS）、藏雞（ZJ）、大骨雞（DG）、茶花雞（CH）、鹿苑雞（LY）、仙居雞（XJ）、白耳雞（BE）等地方雞種來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所；紅色原雞（HY）亞種采自云南省野生動(dòng)物救護(hù)中心。每個(gè)品種隨機(jī)抽取10只雞，采取無菌翅靜脈采血，每只雞采血3 mL，用常規(guī)的酚—氯抽提法，提取DNA，將每個(gè)雞種的10個(gè)個(gè)體的DNA混合，然后4℃保存。

1.2 B-G基因序列分析與構(gòu)建進(jìn)化樹

將DNA樣品送深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測序，所獲序列用以NCBI中Gallus gallus為標(biāo)準(zhǔn)基因庫，并用CLUSTALW軟件對(duì)25個(gè)雞種進(jìn)行對(duì)比分析，篩選B-G基因的SNPs和Indels，運(yùn)用MEGA6軟件鄰接法（NJ）構(gòu)建Phylogenetic tree。

表1 不同雞的B-G基因外顯子SNPs分布Table 1 SNPs distribution of B-G gene in different chick breeds

2 結(jié)果與分析

2.1 B-G基因外顯子SNPs

NCBI中Gallus gallus的B-G基因有16個(gè)外顯子、15個(gè)內(nèi)含子，其中外顯子1 008 bp、內(nèi)含子3 259 bp。25個(gè)雞種的B-G基因外顯子發(fā)生的SNPs見表1，外顯子SNPs相對(duì)較少，僅在斗雞、紅色原雞、綠殼蛋雞、仙居雞中Exon1上發(fā)現(xiàn)一個(gè)堿基突變，來航雞在3個(gè)外顯子上均發(fā)生堿基的突變，堿基突變后相應(yīng)的氨基酸發(fā)生改變，表現(xiàn)出一定的多態(tài)性。

2.2 B-G基因外顯子堿基的Indels

對(duì)25個(gè)雞種的B-G基因上外顯子分析結(jié)果見表2，其中固始雞、斗雞、黑狼山雞、羅斯雞、青腳麻雞、泰和烏骨雞、北京油雞、安卡雞均發(fā)生堿基缺失，其中，斗雞缺失最多，多達(dá)6個(gè)堿基，并且氨基酸也發(fā)生了改變，呈現(xiàn)出一定的多態(tài)性。

2.3 B-G基因中內(nèi)含子SNPs

由圖1可知，25種雞中內(nèi)含子有67個(gè)堿基發(fā)生了突變，其中來航雞、大骨雞、鹿苑雞、蕭山雞、泰和烏骨雞、發(fā)生堿基突變的數(shù)目較多，呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。

2.4 B-G基因中內(nèi)含子Indels

由圖2可知，B-G基因中內(nèi)含子中有327個(gè)堿基發(fā)生插入/缺失，其中紅色原雞、綠殼蛋雞、溧陽雞、泰和烏骨雞、文昌雞、來航雞、雪山草雞、北京油雞的Indels較多，內(nèi)含子呈現(xiàn)出更豐富的多態(tài)性。

2.5 B-G基因進(jìn)化樹分析

用MEGA6軟件構(gòu)建25個(gè)雞種NJ進(jìn)化樹（圖3），樹枝的長度代表了樹的距離，樹枝上顯示Bootstrap 1 000個(gè)循環(huán)設(shè)置的置信度。25個(gè)雞種分為6大類，其中22種雞分為3類；現(xiàn)代肉雞中羅斯與隱性白羽雞聚為1類，而不同類型的中國地方雞種間同源性較小，表明中國地方雞種B-G基因存在多源性進(jìn)化以及豐富的遺傳多樣性，這可能是中國地方雞種與現(xiàn)代商業(yè)品種存在抗性差異的主要原因。

圖1 不同雞的內(nèi)含子SNPs數(shù)量Fig.1 SNPs distribution of introns in different chick breeds

圖2 不同雞的內(nèi)含子Indels數(shù)量Fig.2 　Indels distribution　of intronsin　different chick breeds

圖3 不同雞種NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of different chick breeds

3 討論

哺乳動(dòng)物中都含有MHC基因群［8］，該基因與多種疾病的抗性和生產(chǎn)性能相關(guān)，并且在不同種群中的結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)不同。本研究結(jié)果表明，僅在B-G基因Exon1、2、3、12、15、16上存在堿基的突變和缺失，而其他外顯子沒有發(fā)生SNPs、Indels，呈現(xiàn)出較高的保守性。斗雞、紅色原雞、綠殼蛋雞、仙居雞、來航雞的B-G基因外顯子發(fā)生了SNPs，固始雞、斗雞、黑狼山雞、羅斯雞、青腳麻雞、泰和烏骨雞、北京油雞、安卡雞的外顯子發(fā)生了Indels，并且氨基酸都發(fā)生了改變，可能對(duì)先天免疫性能產(chǎn)生了影響。其中來航雞、固始雞的Exon2分別發(fā)生了堿基的突變和缺失，這與徐日福等［9］研究結(jié)果一致，中國地方雞種的B-G基因第2外顯子呈現(xiàn)出遺傳多態(tài)性，因?yàn)榈?外顯子所編碼的類Ig-V結(jié)構(gòu)域，B-G基因的多態(tài)性與抗原決定簇的結(jié)構(gòu)域相關(guān)。B細(xì)胞、T細(xì)胞表面的特異B-G基因的抗原決定性受體被B簇識(shí)別［10］，由此可見，第2外顯子的多態(tài)性對(duì)免疫學(xué)有重要的作用。斗雞、紅色原雞、綠殼蛋雞、仙居雞在 Exon 1上發(fā)生了堿基的突變，這與商鵬等［11］研究結(jié)果一致，在地方雞種B-G基因第1外顯子發(fā)現(xiàn)了遺傳多態(tài)性，可能第1外顯子多態(tài)性也與抗病性有關(guān)。

在研究外顯子的過程中，內(nèi)含子越來越受到人們的重視，對(duì)內(nèi)含子的研究目前還處于初級(jí)階段，研究內(nèi)含子對(duì)于編碼序列和蛋白質(zhì)的調(diào)控都有重要的作用。王曉斌等［12］有關(guān)內(nèi)含子功能研究的新進(jìn)展表明，mRNA突變主要發(fā)生在內(nèi)含子上，這是由于內(nèi)含子的位置是非常保守的，而長度保守型很低造成的。本次試驗(yàn)內(nèi)含子發(fā)生SNPs位點(diǎn)67個(gè)，Indels位點(diǎn)327個(gè)，也證明了這一點(diǎn)。通過對(duì)25種雞 B-G基因內(nèi)含子發(fā)生SNPs、Indels的研究，為今后深入研究內(nèi)含子的功能提供了參考。

從25個(gè)雞種構(gòu)建進(jìn)化樹中看出，藏雞、來航雞、文昌雞單獨(dú)為一類。來航雞是來自意大利高產(chǎn)蛋雞，與其他雞種存在明顯的起源與進(jìn)化差異，故在進(jìn)化樹上單獨(dú)為一類；藏雞是產(chǎn)自西藏的傳統(tǒng)雞種；文昌雞產(chǎn)自我國海南省的傳統(tǒng)雞種，由于地理位置與生態(tài)類型差異，與其他雞種同源性較低。另外22種雞分為3類，并無規(guī)律可尋，現(xiàn)代商品雞種中隱性白羽雞、羅斯雞聚在一起。我國不同類型的地方雞種同源性很低，例如大體型的溧陽雞、產(chǎn)蛋性能高的仙居雞，這可能與地理位置和長期歷史文化有關(guān)，表明中國地方雞種B-G基因存在多源性進(jìn)化以及豐富的遺傳多樣性，這可能是中國地方雞種與現(xiàn)代商業(yè)品種存在抗性差異的主要影響因素。隱性白羽雞、羅斯雞、安卡雞等外來品種與我國地方雞種并沒有形成單獨(dú)分類，這可能由于20世紀(jì)70年代開始我國部分雞種［13］，如狼山雞、絲羽烏骨雞被引種到國外進(jìn)行雜交、混群造成的。綜上所述，雞的MHC B-G基因存在著豐富的多態(tài)性，這與不同雞種的抗性差異有關(guān)，為利用我國豐富的雞種資源培養(yǎng)出具有高抗病能力的新品種奠定了理論基礎(chǔ)。

（References）：

［1］ 歐陽建華，袁立，孫漢，等.中國泰和烏骨雞MHC與其繁殖性能相關(guān)性能的研究［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22 （1）：99-101. OUYANG J H，YUAN L，SUN H，et al.A study on the relationship of MHC gene variant to breeding performance in chinese Taihe silky fowl［J］.Act Agriculture University Jiangxi，2000，22（1）：99-101.（in Chinese with English abstract）

［2］ 程光潮，黃凡美，周勤宣，等.中國地方雞種種質(zhì)特性［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2000：78-80.

［3］ 于春林，徐亞歐，杜華銳，等.雞MHC基因B-G區(qū)域的生物信息學(xué)分析［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2010，37（5）：26-28. YU C L，XU Y O，DU H R，et al.Bioinformatics analysis of chicken major hiscompatibility complex B-G gene［J］.Sichuan Animal&Veterinary Sciences，2010，37（5）：26-28.（in Chinese）

［4］ BRILES W E，MCGIBBON W H，IRWIN M R.On multiple alleles affecting cellular antigens in the chicken［J］.Genetics，1950，35（6）：633-652.

［5］ 屠云潔，蘇一軍，李國輝，等.江西2個(gè)地方雞品種MCH BG座位多態(tài)性及生物信息學(xué)分析［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，34（3）：29-32. TU Y J，SU Y J，LI G H，et al.MHC B-G loci polymorphism and bioinformatics analysis of two indigenous chicken breeds in Jiangxi［J］.Journal of Yangzhou University，2013，34（3）：29 -32.（in Chinese with English abstract）

［6］ 陳國宏，張勤.動(dòng)物遺傳原理與育種方法［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2009：66-78.

［7］ 李玉祥.中國泰和雞種質(zhì)資源開發(fā)史［J］.自然資源學(xué)報(bào)，1992，4（7）：347-353. LI Y X.Taihe chicken germplasm resources development history［J］.Journal of Natural Resources，1992，4（7）：347-353.（in Chinese with English abstract）

［8］ 周童，馬建民，顧萬君，等.哺乳動(dòng)物MHC密碼子使用概率的聚類分析［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，31（2）：6-10. ZHOU T，MA J M，GU W J，et al.Mammalian MHC codes using the cluster analysis of probability［J］.Journal of Southeast University，2001，31（2）：6-10.（in Chinese with English abstract）

［9］ 徐日福，李奎，陳國宏，等.中國部分地方雞種MHC B-G基因第二外顯子遺傳多態(tài)性［J］.動(dòng)物學(xué)報(bào)，2006，52（1）：160 -169.XU R F，LI K，CHEN G H，et al.Genetic polymorphism within exon 2 of MHC B-G gene in nine Chinese indigenous chicken breeds［J］.Current Zoology，2006，52（1）：160-169.（in Chinese with English abstract）

［10］ SALOMONSEN J，DUNON D，SKJODT K，et al.Chicken major histocompatibility complex-encoded B-G antigens are found on many cell types that are important for the immune system［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1991，88（4）：1359-1363.

［11］ 商鵬，強(qiáng)巴央宗，張浩，等.藏雞MHC B-G基因第1、2外顯子的遺傳多態(tài)性分析［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2009，36（9）：26 -27. SHANG P，QIANG B Y Z，ZHANG H et al.The B-G gene genetic polymorphisms analysis of 1，2 exon in Tibet chicken［J］.Animal Husbandry&Veterinary in Sichuan，2009，36 （9）：26-27.（in Chinese）

［12］ 王曉斌，劉國仰.有關(guān)內(nèi)含子功能研究的新進(jìn)展［J］.中華醫(yī)學(xué)遺傳雜志，2000，17（3）：211-212. WANG X B，LIU G Y.About the new progress in the study of function of introns［J］.Chinese Journal of Medical Genetics，2000，17（3）：211-212.（in Chinese）

［13］ 朱元照.我國引進(jìn)商用品系雞種簡況［J］.中國家禽，1984（3）：21-24. ZHU Y Z.Commercial strains breeds brief introduced into China［J］.China Poulty，1984（3）：21-24.（in Chinese）

（責(zé)任編輯 張 韻）

SNP and Indel analysis of B-G gene of some Chinese chicken breeds

WU Yun，BI Yu-lin，ZHANG Yang，GUO Xiao-min，LI Zhi-teng，WAN Fang，ZHU Peng-fei，XU Lu，CHANG Guo-bin*，XU Qi，CHEN Guo-hong
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

B-G gene of the MHC families is related to the traits of disease resistance in chicken breeds.Investigation on the polymorphism of B-G genes can fundamentally improve the chickens'disease resistance，and then lay a foundation for resistance breeding.In this study，the DNA samples of 25 chicken breeds were used by target capture sequencing method for gene sequencing.Considering B-G gene sequence of Gallus gallus as the reference，we used MEGA6 software for gene analysis to seek out single nucleotide polymorphism（SNP），insertion-deletion（Indel）and the changes of amino acid，and finally constructed the evolutionary tree.The results revealed that exons had 8 SNPs，19 Indels and introns had 67 SNPs，327 Indels in 25 chicken breeds.Amino acids also presented certain polymorphisms and local breeds showed high degree of genetic diversity.This method provided abundant B-G genotypes in the chickens，such as recessive white chicken，Xianju chicken，Leghorns chicken.Leghorns chicken was in separate evolutionary tree for category.Tibetan chickens and Wenchang chickens were also separately categorized due to the geographical location factor.Rose in modern poultry and recessive white chickens gathered for one class，but homolo-gy between different types of Chinese local breeds were smaller.The above experiments showed that there were several origins and plenty of genetic diversities of B-G gene，which resulted in different disease resistance in Chinese indigenous breeds.

chickens；B-G gene；SNPs；Indels；phylogenetic tree

S831.2

A

1004-1524（2016）08-1338-05

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.10

2015-12-30

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31301966）；江蘇省六大人才高峰計(jì)劃資助項(xiàng)目

吳允（1989—），男，山東濰坊人，碩士，從事雞的遺傳育種研究。E-mail：1633988960@qq.com
*

，常國斌，E-mail：passioncgb@163.com