李建省，靳 鋒，王寶蕊甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

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溫腎活血化濕方對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織NF-κB表達(dá)的影響*

李建省，靳 鋒，王寶蕊
甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

目的：探討溫腎活血化濕方對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻（uni l at eral uret eral obst ruct i on，U U O）法致腎間質(zhì)纖維化大鼠腎組織核轉(zhuǎn)錄因子-κB（N F-κB）表達(dá)的影響，初步揭示該方防治腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法：采用U U O建立大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，將雄性SD大鼠80只隨機(jī)分為假手術(shù)組、U U O組、氯沙坦組和溫腎活血化濕方組，每組20只；于造模后第2天開(kāi)始灌胃，假手術(shù)組、U U O組給予等量生理鹽水，氯沙坦組灌胃氯沙坦［10 m g/（kg·d）］，溫腎活血化濕方組灌溫腎活血化濕方湯劑［9.8 m g/（kg·d）］。于造模后第7、14、21天留取梗阻側(cè)腎組織行H E、M asson染色，觀察腎組織病理變化，免疫組化法檢測(cè)腎組織N F-κB的表達(dá)。結(jié)果：第7、14、21天U U O組中N F-κB表達(dá)較假手術(shù)組高（P＜0.05），治療組在第7天較U U O組低（P＜0.05）。結(jié)論：溫腎活血化濕方可能通過(guò)抑制N F-κB的過(guò)度表達(dá)從而延緩腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程。

腎間質(zhì)纖維化；腎組織核轉(zhuǎn)錄因子；溫腎活血化濕方；大鼠

WenShen HuoXue HuaShi prescription；the rats

腎間質(zhì)纖維化(RIF)是各種慢性腎臟病進(jìn)展至慢性腎衰竭的主要原因之一。慢性腎功能衰竭發(fā)病率高、治療困難，RIF在腎臟疾病轉(zhuǎn)歸中起主導(dǎo)作用，其病變程度與慢性腎臟病的預(yù)后密切相關(guān)。尋求其早期可逆因子或防治措施對(duì)腎臟疾病轉(zhuǎn)歸具有重要意義，是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。目前抗RIF的治療多采用抗RAS系統(tǒng)藥物、抗氧化劑、免疫抑制劑、他汀類藥、活性維生素D、吡非尼酮等干預(yù)，但效果不甚理想。中醫(yī)藥工作者從中醫(yī)病因、病機(jī)、治法方面進(jìn)行研究，并從單味中藥、有效成分及中藥復(fù)方防治RIF方面進(jìn)行了大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究，效果滿意。在前期的臨床研究中發(fā)現(xiàn)溫腎活血化濕方具有改善腎功能，降低尿蛋白，延緩慢性腎功能衰竭的功效。本研究利用UUO法復(fù)制腎間質(zhì)纖維化大鼠模型，觀察溫腎活血化濕方對(duì)腎組織結(jié)構(gòu)及N F-κB表達(dá)的影響，初步探討其防治腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型復(fù)制 將清潔級(jí)3～4周齡SD雄性大鼠120只［體質(zhì)量100～140 g，蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(甘)2009-0004］隨機(jī)分為4組：假手術(shù)組、UUO組、溫腎活血化濕方組、氯沙坦組，每組30只。參照文獻(xiàn)［1］采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)(UUO 法)建立腎間質(zhì)纖維化大鼠模型。其余各組以5%水合氯醛3.5 m L/kg腹腔注射麻醉，從右側(cè)旁正中切口剪開(kāi)腹壁，暴露右側(cè)輸尿管，結(jié)扎右側(cè)輸尿管，關(guān)閉腹腔。假手術(shù)組只分離但不結(jié)扎輸尿管。術(shù)后第2天給藥，假手術(shù)組、UUO組給予等量生理鹽水，氯沙坦組灌胃給予氯沙坦［10 m g/(kg·d)］混懸液，溫腎活血化濕方組給予溫腎活血化濕方(由黃芪、川芎、續(xù)斷、牛膝、菟絲子、桂枝、白豆蔻等組成，以上藥物經(jīng)我院制劑室經(jīng)水煮提取，含生藥2 g/m L，按換算系數(shù)換算成大鼠灌胃給藥)水煎液［9.8 m g/(kg·d)］。術(shù)后第7、14、21天分別平均處死每組大鼠10只，切除右腎，甲醛固定、脫水后包埋備用。

1.2 腎組織病理檢測(cè) 取右側(cè)腎組織切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅(H E)、M asson染色，在光鏡下觀察腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化情況

1.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)N F-κB表達(dá)情況 按照兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒(H RP-多聚體抗兔，武漢博士德生物公司提供)操作步驟，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，光鏡下觀察腎組織N F-κB的表達(dá)。光鏡下細(xì)胞核、細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性信號(hào)。采用Im age-Pro Pl us 6.0圖像分析軟件半定量分析免疫組化圖片。根據(jù)累計(jì)吸光度與面積的比值，選取10個(gè)不重疊視野，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以(±s)表示，組間多重比較采用SN K-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腎組織病理學(xué)改變 H E、M asson染色觀察：假手術(shù)組腎小管排列整齊，無(wú)萎縮，腎臟病理改變不明顯。UUO組可見(jiàn)腎間質(zhì)水腫，上皮細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管擴(kuò)張，伴有腎小管萎縮；2治療組腎小管病變程度較UUO組減小。

2.2 免疫組化染色結(jié)果 假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿陽(yáng)性染色較弱；UUO組與假手術(shù)組比較，胞核中陽(yáng)性染色強(qiáng)。UUO組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿陽(yáng)性染色減少。UUO組在術(shù)后第7、14、21天陽(yáng)性染色面積均明顯高于假手術(shù)組(P＜0.05)。2治療組在術(shù)后7天陽(yáng)性染色面積較UUO組減少(P＜0.05)，術(shù)后21天時(shí)UUO組與氯沙坦組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)N F-κB表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較(±s)

表1 各組大鼠腎小管間質(zhì)N F-κB表達(dá)的相對(duì)吸光度值比較(±s)

注：★表示與假手術(shù)組比較，P＜0.05；△表示與U U O組比較，P＜0.05；●表示與氯沙坦組比較，P＜0.05。

組別 只數(shù) 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組 30 0.42±0.21 0.39±0.18 0.41±0.20 U U O組 30 2.93±0.72★●1.65±1.41★1.32±0.58★●氯沙坦組 30 0.87±0.36△0.77±0.39 0.35±0.13△溫腎活血化濕方組 30 0.55±0.30△0.54±0.24 0.64±0.45

3 討論

目前，腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型有單側(cè)輸尿管梗阻(unil ateralureteralobstructi on，UUO)動(dòng)物模型、環(huán)孢素A腎病動(dòng)物模型、5/6腎切除(subtotalnephrectom y，STN x)模型等。UUO模型是研究腎小管間質(zhì)纖維化公認(rèn)的模型。輸尿管結(jié)扎導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化，引起腎臟彌漫性損害［2-3］。

N F-κB是一種介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄因子，具有多向性調(diào)節(jié)作用，調(diào)控一系列重要的免疫因子表達(dá)，參與腎組織損害及腎纖維化形成過(guò)程［2-3］。當(dāng)受到外界信號(hào)的刺激時(shí)，N F-κB由靜止?fàn)顟B(tài)存在于胞漿中的非活性形式迅速活化，并移到胞核中參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及一系列重要的免疫因子表達(dá)，參與腎組織損害過(guò)程［4-6］。

腎間質(zhì)纖維化屬中醫(yī)學(xué)“關(guān)格”“溺毒”“水腫”“虛損”等范疇。劉玉寧認(rèn)為“虛、痰(濁)、瘀、毒”是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵；樊均明以“腎痿”立論；王獻(xiàn)耀教授提出“腎絡(luò)微型癥瘕”是腎纖維化的中醫(yī)病機(jī)?！端貑?wèn)·生氣通天論篇》說(shuō)：“陽(yáng)氣者若天與日，失其所，則折壽而不彰。”《類經(jīng)附翼》說(shuō)：“天之大寶，只此一丸紅日，人之大寶，只此一息陽(yáng)氣?！薄澳I為五臟之本”，陽(yáng)氣的盛衰對(duì)機(jī)體正常的生理活動(dòng)至關(guān)重要。腎中陽(yáng)氣衰虧，則五臟六腑皆失所恃，而陰陽(yáng)病變無(wú)所不至，故溫陽(yáng)法為其治療大法［7］。筆者認(rèn)為虛、瘀、痰濕是導(dǎo)致慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。腎虛為本，痰(濁)、瘀為標(biāo)，毒是加重腎間質(zhì)纖維化不可忽視的方面。因此，溫腎活血化濕法治療慢性腎臟病臨床效果滿意。

目前，國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)TGF-β1/Sm ad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、EM T與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，溫腎活血方治療慢性腎臟病腎間質(zhì)纖維化具有較好的臨床療效，并且發(fā)現(xiàn)溫腎活血方能夠降低UUO大鼠細(xì)胞外基質(zhì)，腎陽(yáng)虛腎絡(luò)瘀阻為腎間質(zhì)纖維化主要病機(jī)，溫腎活血化濕方具有溫腎活血、健脾化濕之功效。已有研究證實(shí)［8］，黃芪、川芎能調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫及體液免疫，降低尿蛋白，保護(hù)腎功能，或通過(guò)下調(diào)TGF-β和α-SM A表達(dá)，或抑制腎小管轉(zhuǎn)分化、下降ECM的主要成分、下調(diào)TGF-β、CTGF表達(dá)等多途徑多靶點(diǎn)抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖，抑制腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，改善腎間質(zhì)纖維化。中藥補(bǔ)腎益氣法能抑制成纖維細(xì)胞過(guò)度活化，促進(jìn)其凋亡［9］。補(bǔ)腎活血法及其中藥可以加速細(xì)胞外基質(zhì)降解，減少細(xì)胞外基質(zhì)積聚，防治腎小球硬化［10］。益氣活血方通過(guò)下調(diào)TGF-β、sm ad 2和上調(diào)sm ad 7的表達(dá)來(lái)抑制CTGF表達(dá)，進(jìn)而遏制腎纖維化的進(jìn)展［11］。

本研究結(jié)果表明溫腎活血化濕方具有良好的抗腎纖維化作用，通過(guò)減少TGF-β1的表達(dá)和減少N F-κB蛋白的活化，使細(xì)胞外基質(zhì)合成及沉積減少，減輕腎間質(zhì)纖維化，為溫腎活血化濕方進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Influence of WenShen HuoXue HuaShi Prescription on the Expressions of NF-κB in Renal Tissue of the Rats with Renal Interstitial Fibrosis

LI Jianshen，JIN Feng，WANG Baorui
Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China

Objective：To reveal the mechanism of WenShen HuoXue HuaShi prescription in preventing and treating renal interstitial fibrosis initially by exploring its influence on the expressions of nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue of unilateral ureteral obstruction（UUO）induced rat model with renal interstitial fibrosis.Methods：Rat model with renal interstitial fibrosis was established by UUO method，eighty rats were separated into sham operation group，UUO group，losartan group and WenShen HuoXue HuaShi prescription group，20 rats each group；they began to lavage from the second day after successfully establishing the models，the rats in the sham operation group and UUO group accepted intragastric administration of physiological saline in the same amounts，losartan group losartan ［10 mg/（kg·d）］，WenShen HuoXue HuaShi prescription group WenShen HuoXue HuaShi decoction［9.8 mg/（kg·d）］.In the seventh，14th and 21st day after successful establishing the models，renal tissue from the obstructed kidney were taken out and dyed by HE and Masson，to observe pathological changes of renal tissue，the expressions of NF-κB were detected in renal tissue by immunohistochemical method.Results：The expressions of NF-κB in UUO group were higher than these of sham operation group in the seventh，14th and 21st day （P＜0.05），the treatment group was lower than UUO group in the expressions of NF-κB at the seventh day（P＜0.05）.Conclusion：WenShen HuoXue HuaShi prescription could delay the progression of renal interstitial fibrosis by inhibiting over expressions of NF-κB possibly.

renal interstitial fibrosis；nuclear factor-κB（NF-κB）in renal tissue；

李建?。?976—），男，博士學(xué)位，副主任醫(yī)師。研究方向：慢性腎臟疾病的中醫(yī)藥防治。

R975.5

A

1004-6852（2016）01-0019-03

2015-02-27

甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào)1308RJZA 164）；甘肅省高等學(xué)?？蒲许?xiàng)目（編號(hào)2013A-082）。