李銘臻 趙文忠 朱志勇 顧 恒 周冰燚 鄭立新

廣東省計(jì)劃生育專科醫(yī)院(廣州，510600)

廣東省免費(fèi)孕前優(yōu)生健康檢查地中海貧血基因檢測結(jié)果分析

李銘臻 趙文忠 朱志勇 顧 恒 周冰燚 鄭立新*

廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院(廣州，510600)

目的：分析近兩年廣東省免費(fèi)孕前優(yōu)生健康檢查地中海貧血基因檢測結(jié)果，為地中海貧血防控工作提供依據(jù)。方法：以廣東省各縣區(qū)參加免費(fèi)孕前優(yōu)生健康檢查的新婚夫婦為研究對象，MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作為地中海貧血篩查陽性指標(biāo)，夫婦雙方篩查均為陽性時(shí)，需同時(shí)進(jìn)行α及β地中海貧血基因檢測。結(jié)果：16240例篩查陽性者中發(fā)現(xiàn)基因攜帶者12995例(80.0%)準(zhǔn)確率為80.0%，部分縣區(qū)>90%。發(fā)現(xiàn)3382對夫婦有妊娠重型地中海貧血胎兒的可能，產(chǎn)前診斷的需求率為41.65%。結(jié)論：MCV聯(lián)合MCH作為篩查地中海貧血陽性指標(biāo)可靠，操作簡單，便于在基層應(yīng)用，但需加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制。

地中海貧血；篩查；準(zhǔn)確性；防控

地中海貧血(簡稱地貧)是由于α和(或)β珠蛋白基因發(fā)生突變或缺失，使得血紅蛋白中一種或幾種珠蛋白肽鏈不能合成或合成速率降低，導(dǎo)致血紅蛋白中珠蛋白鏈生成失去平衡，而造成的溶血性貧血[1]。地貧有明顯的地域、人群差異，多見于地中海、非洲、東南亞等地區(qū)，廣東省是我國地貧高發(fā)的省份之一[2]。本病重型患者目前尚無法根治，通過血液學(xué)的篩查、地貧基因診斷，對同型地貧的高風(fēng)險(xiǎn)夫婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷，淘汰重型胎兒，是目前預(yù)防本病最有效的方法[3]。2012年起，廣東省在全省范圍內(nèi)進(jìn)行地貧防控工作，已初步取得顯著成效。本研究對相關(guān)資料進(jìn)行分析，為防控提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年11月～2014年12月，參加廣東省各縣區(qū)、街道(鎮(zhèn))婚育學(xué)校學(xué)習(xí)的育齡夫婦。對育齡夫婦進(jìn)行免費(fèi)孕前優(yōu)生健康檢查，發(fā)現(xiàn)夫婦地貧篩查結(jié)果均為陽性后，進(jìn)行地中海貧血基因檢測。以篩查陽性16240人(8120對夫婦)作為研究對象。

1.2 方法

1.2.1 地貧篩查 由廣東省各縣區(qū)計(jì)劃生育服務(wù)站、當(dāng)?shù)蒯t(yī)院進(jìn)行。各檢測機(jī)構(gòu)按技術(shù)規(guī)范的要求，用全自動血細(xì)胞分析儀對血液樣本進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)室每天進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制，每年全省進(jìn)行2～4次的室間質(zhì)量控制。以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg作為地貧篩查陽性指標(biāo)。當(dāng)夫婦雙方地貧篩查均為陽性時(shí)，將該夫婦血樣通過快遞形式郵寄到廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院進(jìn)行地貧基因檢測。

1.2.2 血樣郵寄 由潮州凱普生物化學(xué)有限公司提供地中海貧血篩查血樣本采集卡(簡稱采集卡)。各篩查機(jī)構(gòu)將地貧篩查陽性的血樣滴進(jìn)采集卡，自然風(fēng)干，分別裝進(jìn)專用密封袋后快遞到廣東省計(jì)劃生育?？漆t(yī)院優(yōu)生技術(shù)中心。收到快遞后，中心先檢查裝有采集卡的密封袋是否完好，血斑是否合符要求、有無發(fā)霉等異常情況。對不符合檢測要求的血樣，要求當(dāng)?shù)刂匦录乃蜆?biāo)本；合格的血樣同時(shí)進(jìn)行α及β地貧基因檢測。

1.2.3 地貧基因檢測 DNA提取、α和β地貧基因擴(kuò)增、反向斑點(diǎn)雜交以及雜交膜條顯色均使用潮州凱普生物化學(xué)有限公司提供的血液基因組DNA提取試劑盒及α-和β-地中海貧血基因檢測試劑盒，(國食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400399號)，嚴(yán)格按說明書上的步驟、條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。主要步驟為：①DNA提取，將采集卡上的血斑剪下，用血液基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提?。虎讦恋刎毣驍U(kuò)增，DNA樣本6ul，反應(yīng)總體系45ul按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃，15min后進(jìn)入35個(gè)循環(huán)：98℃，40sec；64℃，70sec；72℃，150sec；72℃，5min；4℃保存；③β地貧基因擴(kuò)增，DNA樣本3ul，反應(yīng)總體系50ul按以下程序進(jìn)行擴(kuò)增：37℃，5min ；94℃，3min后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)：94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec；72℃，5min；4℃保存；④雜交、顯色，用試劑盒內(nèi)配套的試劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在導(dǎo)流雜交儀中放置好地貧基因反向斑點(diǎn)雜交膜條后，加入經(jīng)過變性的α地貧和β地貧PCR產(chǎn)物，進(jìn)行雜交、顯色。全過程均在導(dǎo)流雜交儀中進(jìn)行，顯色后的雜交膜條晾干后可長期保存。

1.3 地貧基因檢測結(jié)果判讀

地貧基因反向斑點(diǎn)雜交膜條設(shè)3個(gè)α和6個(gè)β正常對照點(diǎn)，可同時(shí)檢測3種α地貧缺失型基因(SEA、3.7、4.2)、3種突變型基因(CS、QS、WS)及15種常見β地貧突變型基因。每次實(shí)驗(yàn)所有正常對照點(diǎn)均應(yīng)顯色，突變純合子及缺失純合子除外，否則需重新進(jìn)行全部實(shí)驗(yàn)，從提取DNA進(jìn)行PCR到雜交、顯色。圖1為雜交膜條上各雜交位點(diǎn)對應(yīng)圖，出現(xiàn)地貧基因突變、缺失時(shí)在相應(yīng)位置會出現(xiàn)雜交信號。圖2-5為不同類型地貧基因攜帶者的雜交膜條掃描圖，依次分別為α地貧3.7缺失雜合子、β地貧41-42突變雜合子、α地貧3.7缺失純合子以及α地貧WS突變復(fù)合β地貧41-42突變雜合子。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

資料采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。描述性統(tǒng)計(jì)用地貧篩查的準(zhǔn)確率(基因檢測陽性/初篩陽性)和可能妊娠重型地貧兒的百分比。方差分析比較地貧基因攜帶者與非地貧基因攜帶者M(jìn)CV、MCH水平，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 地貧篩查及基因檢測結(jié)果

16240例地貧篩查陽性者中，發(fā)現(xiàn)12995例地貧基因攜帶者，占80.0%。α地貧基因攜帶9224例，占基因陽性者的80.0%，β地貧基因攜帶4419例，占34.0%，其中 648例α復(fù)合β地貧基因攜帶，占5.0%。地貧基因攜帶者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg的12564例，占96.7%；MCV≤82 fl，MCH>27pg的85例，占0.7%；MCV>82 fl，MCH≤27pg的346例，占2.7%。

2.2 各縣區(qū)檢測準(zhǔn)確率

全省121個(gè)縣區(qū)中持續(xù)送檢的80個(gè)，其中送檢標(biāo)本量超過300例的縣區(qū)共有15個(gè)，分別計(jì)算其地貧篩查準(zhǔn)確率(地貧基因攜帶例數(shù)/送檢總數(shù))，按準(zhǔn)確率從高到低排序，結(jié)果如表1所示。16240例送檢對象的MCV、MCH分別為70.45±6.61 fl，22.76±3.01 pg。比較地貧組和非地貧組MCV和MCH水平，地貧組的MCV和MCH均比非地貧組低(P<0.001)。

表1 送檢標(biāo)本量>300例的縣區(qū)準(zhǔn)確率統(tǒng)計(jì)表

表2 16240名調(diào)查對象MCV和MCH水平

2.3 重型地貧兒妊娠概率

8120對夫婦中有3382對夫婦可能妊娠重型地貧兒(41.65%)，其中可能妊娠巴氏水腫胎2705對，占79.98%；可能妊娠重型β地貧660對，占19.52%；可能妊娠巴氏水腫胎或重型β地貧17對，占0.50%。產(chǎn)前診斷需求為41.65%。

3 討論

3.1 MCV聯(lián)合MCH篩查地貧便于基層，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制需加強(qiáng)

廣東省是我國地貧的高發(fā)省份之一，以往資料顯示廣東省α地貧基因攜帶率為8.30%～8.85%[4-5]，β地貧基因攜帶率為3.36%～3.73%[2，6]。地貧的篩查方法多樣，有紅細(xì)胞脆性一管法、血紅蛋白電泳等，經(jīng)過多年的驗(yàn)證，MCV、MCH聯(lián)合篩查能提高地貧檢測的靈敏度[3，7]。近兩年在全省地貧防控工作中，以MCV≤82 fl或(且)MCH≤27pg聯(lián)合作為地貧篩查陽性的指標(biāo)，以降低漏診率。本次全省地貧篩查陽性篩查率為80.0%，部分縣區(qū)>90%，可見以MCV及MCH作為地中海貧血篩查的陽性指標(biāo)是簡單而且可靠的，便于在基層推廣應(yīng)用。在12995例地貧基因攜帶者中，MCV≤82 fl且MCH≤27pg 12564例，MCV≤82 fl，MCH>27pg的346例；MCV>82 fl，MCH≤27pg的85例，即只有一項(xiàng)篩查指標(biāo)陽性的431例，占3.32%(431/12995)。所以MCV、MCH聯(lián)合篩查有助于提高地貧篩查的靈敏度，降低漏診率。

在送檢標(biāo)本量>300例的15個(gè)縣區(qū)中，篩查準(zhǔn)確率最高的達(dá)94.23%，而最低的只有53.86%，存在明顯的差距。因此，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制必須定期進(jìn)行。開展實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量控制，可促進(jìn)各實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量和水平的提升[8]。加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)量控制后，MCV聯(lián)合MCH作為地中海貧血篩查陽性指標(biāo)的準(zhǔn)確率有望得到進(jìn)一步提高，對減少地貧基因檢測費(fèi)用的投入，地貧的研究均有重大意義。

3.2 地貧防控工作任務(wù)艱巨，必須加大防控力度

根據(jù)孟德爾遺傳定律，夫婦雙方α地貧基因中同時(shí)攜帶--SEA時(shí)，有1/4的機(jī)會妊娠巴氏水腫胎；同為β地貧突變基因攜帶時(shí)妊娠重型β地貧兒的概率為1/4；而雙方均為--SEA攜帶復(fù)合β地貧時(shí)妊娠重型地貧兒的概率為7/16?？赡苋焉锇褪纤[胎的有2705對夫婦；可能妊娠重型β地貧兒的有660對；兩者均有可能的有17對。上述合計(jì)3382對夫婦有必要進(jìn)行產(chǎn)前診斷，避免重型地貧兒的出生，尤其是重型β地貧兒。夫婦雙方地貧篩查均為陽性后，產(chǎn)前診斷的需求率為41.65%。其中可能妊娠巴氏水腫胎的占大多數(shù)(80%)，這與廣東人群α地貧基因攜帶率高于β地貧基因攜帶有關(guān)[2-6]。

市級醫(yī)院陸續(xù)開展地貧基因檢測項(xiàng)目，其下屬縣區(qū)的地貧基因檢測可于當(dāng)?shù)剡M(jìn)行。全省121個(gè)縣區(qū)近兩年有持續(xù)送標(biāo)本至本中心檢測的有80個(gè)，所以全省妊娠重型地貧兒的可能數(shù)目將超過上述數(shù)字。若地貧基因攜帶的夫婦從優(yōu)生角度考慮，血紅蛋白H病等中間型地貧胎兒也進(jìn)行淘汰，產(chǎn)前診斷的需求率將更高。2010年第六次全國人口普查的數(shù)據(jù)顯示，廣東省已成為全國人口數(shù)量第一大省，人群數(shù)量龐大，地貧攜帶率高。廣東省進(jìn)行地貧防控已有多年，已取得初步成效及經(jīng)驗(yàn)，但防控工作任務(wù)依然艱巨，需繼續(xù)加大防控力度。

[1] 茅矛,杜傳書,王箐,等.地中海貧血的紅細(xì)胞抗氧化酶和核苷酸代謝酶活性變化[J].中國病理生理雜志,1994,10(6):477-481.

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[責(zé)任編輯：董 琳]

Analysis of results of thalassemia genes testing in project of free pre-pregnancy aristogenesis detecting of Guangdong province

LI Mingzhen, ZHAO Wenzhong, ZHU Zhiyong, GU Heng, ZHOU Bingyi, ZHENG Lixin*

FamilyPlanningSpecialHospitalofGuangdong,Guangdong, 510600

*Correspondingauthor：ZhengLixin，Email:605512183@qq.com

Objective: To analyze thalassemia gene detecting results in nearly two years of free pre-pregnancy eugenics health examination of Guangdong province, and to provide evidences for preventing and controlling halassemiathe. Method: Newly married couples who attended the free pre-pregnancy health care of Guangdong were recruited. MCV≤82 fl or (and) MCH≤27 pg was positive indicators for thalassemia screening . When the screening results of both husband and wife were positive, α and β thalassemia gene was detected subsequently. Result: In the 16240 cases whose thalassemia screening results were positive, 12995 cases were diagnosed as thalassemia gene carriers. According to the statistics, the accuracy rate of thalassemia screening was 80.02% in Guangdong province, and accuracy rate were even more than 90% in some counties. At the same time, 3382 couples had fetus with risk of severe thalassemia, so 41.65% couples needed to recieve prenatal diagnosis. Conclusion: MCV combining with MCH as the positive indicator for thalassemia screening is reliable. And it is easy to be used in the grass-root service setting because of simpleness for operation. However, laboratory quality control should be strengthened. The prevention and controlling thalassemia should be strengthened as it is a hard work.

Thalassemia; Screen; Accuracy; Prevention and controlling

廣東省人口計(jì)生委基金項(xiàng)目(20132035)

2015-03-10

2016-05-19

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.07

*通訊作者：605512183@qq.com