張　衛(wèi)　梁世嬌　林文敏

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【實(shí)驗(yàn)研究】

隔藥灸對(duì)UC大鼠血清Th17相關(guān)細(xì)胞因子的影響*

張衛(wèi)1△梁世嬌2林文敏3

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)B門(mén)市中醫(yī)院針灸科(廈門(mén) 361009)；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院七年制針灸推拿學(xué)碩士研究生2009級(jí)(福州 350122)；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院碩士研究生2013級(jí)(福州 350122)

摘要：目的探討隔藥灸對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠(UC)血清Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制。方法將SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、隔藥灸組和西藥組4組，采用免疫法加局部刺激造模，用ELISA 法檢測(cè)大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TGF-β、IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。結(jié)果UC大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL- 1β水平均高于正常大鼠(P<0.05),而TGF-β低于正常組(P<0.05)。經(jīng)過(guò)治療后，隔藥灸組和西藥組大鼠血清IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β 均較模型組顯著降低(P<0.05)，而TGF-β均較模型組顯著升高(P<0.05)。隔藥組在下調(diào)大鼠血清IL-17、IL-23明顯優(yōu)于西藥組(P<0.05)，而在IL- 6、TNF-α、IL-1β、TGF-β的調(diào)控上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論隔藥灸能夠調(diào)控UC大鼠血清Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子的水平，這可能是隔藥灸治療UC的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：隔藥灸；潰瘍性結(jié)腸炎；Th17；細(xì)胞因子

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種非特異性炎癥性腸病，免疫反應(yīng)異常被認(rèn)為是UC發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)，近年來(lái)研究表明Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子,尤其是IL-17/IL-23炎癥軸在UC的發(fā)病中具有重要的作用[1,2]。臨床上我們可以IL-23、IL-17作為新的切入點(diǎn), 尋找更有效的治療方法。已有研究表明，隔藥灸治療UC在近期療效、遠(yuǎn)期療效及調(diào)節(jié)Th1、Th2介導(dǎo)的免疫功能上具有良好的優(yōu)勢(shì)。本研究通過(guò)觀察UC大鼠血清中Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL- 6、TGF-β、TNF-α、IL-1β表達(dá)的變化,探討隔藥灸治療潰瘍性結(jié)腸炎對(duì)Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子的可能作用機(jī)理。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用體質(zhì)量為(200±10)g的雄性清潔級(jí)SD(Sprague Dawley)大鼠44只, 由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。所有動(dòng)物購(gòu)回后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，即納入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組12只、模型組32只。

1.2主要試劑和儀器藥餅由附子、肉桂、當(dāng)歸、紅花、黃連、木香等中藥研末, 加適量黃酒調(diào)和, 用特制模具制成直徑為0.5cm 的藥餅；柳氮磺吡啶(SASP)250mg/片購(gòu)自上海三維制藥有限公司；IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1βELISA試劑盒購(gòu)自杭州力拓生物技術(shù)有限公司；2%戊巴比妥鈉購(gòu)自北京普博斯生物。ELX808 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tck公司；低溫高速離心機(jī)LABOFUGE400R購(gòu)自德國(guó)HERAEUS；ELT-13V-85V34超低溫冰箱購(gòu)自美國(guó)HARIS公司。

1.3模型制備和模型鑒定

1.3.1模型制備參照吳煥淦等[3]的方法制備UC大鼠模型, 以UC患者的結(jié)腸作為抗原采用免疫學(xué)方法制備實(shí)驗(yàn)性UC大鼠模型。UC患者的新鮮結(jié)腸來(lái)自于外科結(jié)腸樣本,加入適當(dāng)生理鹽水,3000r/min離心30min,上清液提純測(cè)定蛋白質(zhì)含量, 并與Freund佐劑混合配成乳劑。造模大鼠首次于后足趾皮下注射抗原1ml(蛋白含量6mg),并分別在第10、17、24、31天于前足趾皮下、背部皮下、腹股溝皮下、腹腔內(nèi)注射抗原1ml(蛋白含量6mg,腹腔內(nèi)注射不加完全弗氏佐劑),至第38天造模大鼠用2%戊巴比妥鈉30mg/kg 腹腔麻醉后, 用3%甲醛2mL灌腸,留置1h,用生理鹽水沖洗2次,再用抗原液(12mg/ml不加佐劑)2 ml灌腸,留置2h,生理鹽水沖洗。正常組用生理鹽水做與模型組相同操作。

1.3.2模型鑒定及分組造模結(jié)束后, 隨機(jī)選取模型組和正常組大鼠各2只斷頭處死, 通過(guò)結(jié)腸HE 染色, 鑒定造模是否成功。在確定模型制備成功的基礎(chǔ)上,將模型組剩余30只動(dòng)物隨機(jī)分為隔藥組10只，模型組10只，西藥組10只。

1.4分組與治療

1.4.1正常組(10只)正常大鼠,做與隔藥灸組相同的固定。

1.4.2模型組(10只)不作任何治療,只做與隔藥灸組相同的固定。

1.4.3隔藥灸組(10只)取穴“天樞(雙)”“氣?！薄爸须洹?。穴位定位根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》(林文注,上海科學(xué)技術(shù)出版社,1994年)。每日隔藥餅灸1次,每次每穴灸2壯,共灸14天。

1.4.4西藥組(10只)柳氮磺胺吡啶(SASP)溶液灌胃。每日投藥量按成人(70kg 體質(zhì)量)與大鼠(200 g體質(zhì)量)1∶0.018比例根據(jù)《中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》(李儀奎,上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1991年)配制SASP溶液,每次灌胃3 ml,每日2次,共灌胃14天。

治療結(jié)束后, 用2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，心臟取血6 ml，注入肝素抗凝管內(nèi)，3600轉(zhuǎn)/分鐘離心15 min，取上層血清3ml，測(cè)定各組細(xì)胞因子含量，取血結(jié)束后各組大鼠斷頸處死。

1.5檢測(cè)指標(biāo)采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β含量，具體步驟按ELISA試劑盒操作。

2　結(jié)果

各組大鼠血清IL-17、IL-23、IL-1βIL-6、TNF-α、TGF-β的水平，結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

表1　大鼠血清IL-17、IL-23、IL-1β水平　(ng/L)

注：1)與正常組比較P<0.05；2)與模型組比較P<0.05;3)與西藥組比較P<0.05

表2　大鼠血清IL-6、TNF-α、TGF-β水平 　(ng/L)

注：1)與正常組比較P<0.05；2)與模型組比較P<0.05

3　討論

在中醫(yī)學(xué)中，根據(jù)臨床特點(diǎn),UC當(dāng)屬中醫(yī)“下利”“腸澼”“痢疾”“腹痛”“便血”“臟毒”等范疇。

多位學(xué)者認(rèn)為本病病位標(biāo)在大腸，本在脾腎，其病機(jī)主要以脾腎陽(yáng)虛為本，瘀血阻滯為標(biāo)，且他們采用溫腎健脾、 益氣活血為主要治法均取得了良好的療效[4～6]。故我們采用隔藥灸治療UC，以臟腑、氣血、經(jīng)絡(luò)為依據(jù),以腧穴功效為基礎(chǔ),以溫補(bǔ)脾腎,疏調(diào)腸腑氣血為治療原則進(jìn)行針灸處方,采用通十二經(jīng)、理氣血之艾葉作為施灸材料,并設(shè)計(jì)制作了溫陽(yáng)、行氣活血之藥餅,在氣海、中脘、天樞等穴進(jìn)行治療。

UC多因脾胃虛弱復(fù)感外邪、飲食不潔、情志不暢，導(dǎo)致腸腑氣機(jī)失調(diào)，發(fā)為腹瀉。失治誤治，反復(fù)發(fā)作，久瀉不愈，必傷及腎，引起脾腎陽(yáng)虛，加重腹瀉?！毒霸廊珪?shū)·泄瀉》曰：“腎為胃之關(guān)，開(kāi)竅于二陰，所以二便之開(kāi)閉，皆腎臟所主，今腎中陽(yáng)氣不足，則命門(mén)火衰……即令人洞泄不止也?！比还湃嗽啤熬脼a無(wú)火”，即久瀉可腎陽(yáng)損傷，腎陽(yáng)不足，命門(mén)火衰，不能溫煦脾陽(yáng)，虛寒內(nèi)生，運(yùn)化失調(diào)，可見(jiàn)瀉下不止或雞鳴瀉，泄瀉與脾腎相互作用，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致本病遷延難愈。又《景岳全書(shū)·雜證謨》載：“凡里急后重者，病在廣腸最下處，而其病本，則不在廣腸，而在脾腎……欲治此者，但當(dāng)察其所因，以治脾腎之本”，可見(jiàn)里急后重與脾腎相關(guān)。故筆者認(rèn)為本病病位在腸，與脾胃密切相關(guān)，久必及腎，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，脾腎陽(yáng)氣在發(fā)病中起關(guān)鍵作用，故脾腎陽(yáng)虛為本病的主要證侯。故本研究選穴氣海、中脘、天樞寓意標(biāo)本兼治，三穴配合共奏溫養(yǎng)脾腎、通調(diào)氣血、調(diào)和陰陽(yáng)之功。

研究表明隔藥灸在治療UC具有可靠的療效，同時(shí)可以糾正結(jié)腸黏膜病變, 近期痊愈率達(dá)52.5 %[7]。相關(guān)機(jī)理研究顯示隔藥灸可以調(diào)整UC大鼠的腸道菌群紊亂，并可有效抑制TNF-α、IL-12的過(guò)度表達(dá)[8]；可以調(diào)節(jié)IL-1β等諸多基因的表達(dá)、下調(diào)潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜組織IL-8及其mRNA的表達(dá)[9], 抑制ICAM-1及其mRNA 的表達(dá)[10]等等，從而起到治療作用。

為進(jìn)一步探討隔藥灸治療UC的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β、TNF-α、IL-1β水平及隔藥灸的影響進(jìn)行了研究。

本項(xiàng)研究結(jié)果顯示模型組、隔藥灸組、西藥組UC大鼠血清促炎因子IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β水平明顯高于正常組，與大多數(shù)研究者的結(jié)果一致，同時(shí)隔藥灸組、西藥組較模型組的表達(dá)水平降低。表明隔藥灸能夠降低UC大鼠結(jié)腸血清異常增高的IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β的表達(dá), 提示隔藥灸治療UC大鼠的可能途徑之一是通過(guò)調(diào)控促炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL- 6、TNF-α、IL-1β的表達(dá), 來(lái)減輕或消除腸道炎癥。UC大鼠血清TGF-β水平較正常組顯著降低，抗炎作用減弱，導(dǎo)致結(jié)腸炎性反應(yīng)的加劇，同時(shí)通過(guò)隔藥灸可以上調(diào)UC大鼠血清TGF-β水平抑制炎癥的發(fā)展。本研究還顯示隔藥灸組血清IL-17、IL-23的表達(dá)較西藥組的降低，IL-23、IL-17是IL-23/IL-17軸主要的炎癥因子，研究提示隔藥灸組在降低血清的IL-17、IL-23水平優(yōu)于西藥組，筆者認(rèn)為這可能是隔藥灸治療UC的優(yōu)勢(shì)之一。

綜上，本研究提示隔藥灸能夠調(diào)控UC大鼠血清Th17主要相關(guān)細(xì)胞因子的水平，這可能是隔藥灸治療UC的主要機(jī)制之一。在相關(guān)TGF-β的研究中，經(jīng)過(guò)治療后UC大鼠TGF-β血清含量有升也有降，在本研究中，TGF-β在UC大鼠血清表達(dá)明顯降低。有學(xué)者認(rèn)為T(mén)GF-β在潰瘍性結(jié)腸炎的早期起著抗炎作用，之后則起著促炎的作用，故TGF-β在UC大鼠發(fā)病中的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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*基金項(xiàng)目：廈門(mén)市科技局指導(dǎo)項(xiàng)目(No.ZD2011S0390)

通訊作者△

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.08.018

文章編號(hào)：1003-8914(2016)-08-1091-04

收稿日期：(本文校對(duì)：葉清景2015-09-01)

Effects of Herb-partitioned Moxibustion of Thl7 Major Related Cytokines

ZHANG Wei1△LIANG Shijiao2LIN Wenmin3

(1.Department of Acupuncture and Moxibustion, Xiamen Hospital of TCM affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Xiamen 361009, China；2.Grade 2009 Graduate of Seven-year System, College of Acupuncture and Tuna,Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Fuzhou 350122, China；3. Grade 2013 Graduate, College of Acupuncture and Tuna, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fujian, Fuzhou 350122, China)

Abstract：ObjectiveTo explore the regulatory mechanism of herb-partitioned moxibustion of Thl7 major related cytokines on the serum of ulcerative colitis (UC) rats. MethodsSD rats were randomly divided into normal group, model group, herb-partitioned moxibustion group and medicine group. A rat model of UC was made by an immunological method plus local stimulation. The serum levels of IL-17, IL-23, IL- 6, TGF-β, IL-1β and TNF-α were detected by ELISA method. Result Serum levels of IL-17, IL-23, IL- 6, IL-1β and TNF-α in UC rats were higher than those in the normal group (P<0.05), whereas the serum level of TGF-β was lower than that of the normal group (P<0.05). After treatment, levels of IL-17, IL-23, IL- 6, IL-1β and TNF-α of herb-partitioned moxibustion group and medicine group decreased obviously when comparing with model group (P<0.05), and TGF-β increased obviously (P<0.05) in the serum of both the herb-partitioned moxibustion group and medicine group comparing with the model group. Comparing with the medicine group, serum levels of IL-17 and IL-23 of the herb-partitioned moxibustion group decreased obviously (P<0.05), and there was no statistical significance (P>0.05) in the level of TGF-β, IL-1β and TNF-α. Conclusion Herb-partitioned moxibustion can regulate levels of Thl7 major related cytokines in the serum of UC Rats. This may be one of the mechanisms of herb-partitioned moxibustion treatment for UC.

Key words：Herb-partitioned moxibustion; Ulcerative colitis; Th17; Cytokine