張志華　鄭必霞　李玫　金玉　林謙

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一例Rotor綜合征SLCO1B1和SLCO1B3基因突變分析

張志華鄭必霞李玫金玉林謙

目的初步探討1例Rotor綜合征患者的臨床特點(diǎn)和SLCO1B1和SLCO1B3基因突變情況，從分子遺傳學(xué)角度分析該疾病的發(fā)生機(jī)制。方法收集患者臨床資料，從外周血白細(xì)胞提取基因組DNA，采用二代測序進(jìn)行四千種已知單基因遺傳性疾病篩查，用Sanger測序法分析驗(yàn)證二代測序發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)。結(jié)果患兒主要臨床表現(xiàn)為反復(fù)皮膚及鞏膜黃染，實(shí)驗(yàn)室檢查示高膽紅素血癥，直接、間接膽紅素雙向增高。高通量測序發(fā)現(xiàn)患兒攜帶SLCO1B1基因c.1738 C>T純合突變和SLCO1B3基因c.360_481 del純合突變。c.1738 C>T突變?yōu)闊o義突變，已有文獻(xiàn)報(bào)道，推測導(dǎo)致蛋白的第580位氨基酸密碼子由精氨酸變?yōu)榻K止密碼子。c.360_481 del突變?yōu)橐拼a突變，蛋白編碼區(qū)的第360至481位堿基缺失。該變異未見文獻(xiàn)報(bào)道，也未見SNP數(shù)據(jù)庫收錄。此變異使蛋白缺失40個(gè)氨基酸的同時(shí)還造成開放閱讀框移碼，可能造成蛋白功能喪失。結(jié)論SLCO1B1和SLCO1B3基因突變導(dǎo)致的有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP1B1和OATP1B3功能缺陷是該Rotor綜合征患者臨床表現(xiàn)的分子遺傳基礎(chǔ)。

Rotor綜合征；SLCO1B1基因；SLCO1B3基因

本研究分析1例Rotor綜合征患者的臨床特點(diǎn)和SLCO1B1和SLCO1B3基因突變情況，從分子遺傳學(xué)角度初步探討該疾病的發(fā)生機(jī)制。

資料和方法

一、病例資料

患者，男，11歲5個(gè)月，因反復(fù)皮膚及鞏膜黃染11年入院?；純撼錾? d患新生兒黃疸，經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)出院，1個(gè)月后再次出現(xiàn)皮膚及鞏膜黃染，治療后病情好轉(zhuǎn)，但仍會(huì)反復(fù)出現(xiàn)皮膚及鞏膜輕度黃染，后一直未治療也未定期復(fù)查。2014年，家長發(fā)現(xiàn)患兒皮膚及鞏膜再次黃染并逐漸加重，遂來就診。入院體格檢查：T 37.1 ℃，P 76次/min，R 18次/min，BP 114/68 mmHg，神志清楚，精神反應(yīng)可，呼吸平穩(wěn)，皮膚及鞏膜輕度黃染，皮膚粗糙。全身查體未見異常。腹部B型超聲：肝、胰、脾未見明顯占位病變。胸腹立位X線片未見特殊。MRCP：肝內(nèi)外膽管未見明顯異常。

血生化檢查結(jié)果：ALT 20 U/L，AST 26 U/L，總膽紅素102.1 μmol/L，直接膽紅素57.5 μmol/L，間接膽紅素44.6 μmol/L，堿性磷酸酶181 U/L，谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶12 U/L。

二、方法

(一) DNA提取收集患者靜脈抗凝血2 mL，用TIANGEN全血基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN BIOTECH CO.LTD,BEIJING)抽提患者及父母DNA，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(二) 二代測序常見遺傳性疾病篩查經(jīng)患者父母親同意，抽取患者外周血2 mL，委托北京德易東方臨床檢驗(yàn)所應(yīng)用二代測序進(jìn)行四千種已知單基因遺傳性疾病篩查。

(三) PCR及一代測序驗(yàn)證方法取患者新鮮全血，使用BloodGen Midi Kit (CWBIO, China) 提取患者全基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。根據(jù)SLCO1B1、SLCO1B3和UGT1A1基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s, 55 ℃退火30 s，72 ℃ 鏈延伸1 min，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃補(bǔ)充延伸10 min。PCR 的體系均為50 μL。引物序列見表1。各基因所驗(yàn)證位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用ABI 3730XL 測序儀測序，測序引物采用原PCR引物?；蛐蛄蟹治霾捎肈NASTAR軟件進(jìn)行序列分析和比對。

結(jié)　　果

一、二代測序結(jié)果

四千種已知單基因遺傳性疾病篩查發(fā)現(xiàn)3個(gè)與患者臨床表現(xiàn)相關(guān)的可疑突變(表2)。

二、PCR及一代測序驗(yàn)證結(jié)果

Sanger測序結(jié)果顯示患者SLCO1B1基因c.1738 C>T純合突變(圖1A)，UGT1A1基因測序結(jié)果顯示c.1091C>T雜合突變(圖1B)。SLCO1B3基因c.360_481 del突變進(jìn)行PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳和Sanger測序驗(yàn)證。c.360_481 del區(qū)域?yàn)镾LCO1B3基因整個(gè)外顯子4缺失，針對該缺失區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，片段設(shè)計(jì)大小為801 bp，PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)患者樣本無條帶，正常對照樣本800 bp處有一明顯條帶(圖1C)。進(jìn)一步針對外顯子4及側(cè)翼序列Sanger測序結(jié)果驗(yàn)證了c.360_481 del區(qū)域缺失突變。

表1　驗(yàn)證位點(diǎn)分析引物序列

表2　基因變異位點(diǎn)基本信息

A. 患者SLCO1B1基因c.1738 C>T純合突變位點(diǎn)測序圖；B. 患者UGT1A1基因c.1091C>T雜合突變位點(diǎn)測序圖；C. SLCO1B3基因PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖電泳圖。1為患者樣本；2為正常對照樣本

圖1患者基因變異位點(diǎn)驗(yàn)證

三、診斷結(jié)果

根據(jù)患兒臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)皮膚及鞏膜黃染，實(shí)驗(yàn)室檢查示高膽紅素血癥，直接、間接膽紅素雙向增高，肝腎功能及血常規(guī)未見異常，膽汁酸濃度不高，考慮高結(jié)合膽紅素血癥。根據(jù)SLCO1B1和SLCO1B3基因雙純合突變結(jié)果確診為Rotor綜合征。

討　　論

Rotor綜合征又稱遺傳性結(jié)合型膽紅素增高Ⅱ型，屬常染色體隱性遺傳病，主要是由于肝細(xì)胞對膽紅素和有機(jī)陰離子的攝取、儲存和排泄障礙，導(dǎo)致血清內(nèi)結(jié)合膽紅素和非結(jié)合膽紅素均增高[1]。出生后不久或童年開始出現(xiàn)間歇性黃疸。鞏膜黃疸也可能是唯一的臨床表現(xiàn)[2]。SLCO1B1和SLCO1B3雙等位基因突變導(dǎo)致溶質(zhì)載體超家族有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽OATP1B1和OATP1B3功能缺陷引起Rotor綜合征[3]。SLCO1B1基因位于12p12.2-p12.1，含15個(gè)外顯子，其中14個(gè)外顯子編碼大小為691個(gè)氨基酸殘基的OATP1B1蛋白[4]。SLCO1B3基因位于12p12.2，同樣含15個(gè)外顯子，其中14個(gè)外顯子編碼大小為702個(gè)氨基酸殘基的OATP1B3蛋白[4]。OATP1B1和OATP1B3均在肝細(xì)胞中表達(dá)[5]。人類基因突變數(shù)據(jù)庫(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中目前收錄了25種SLCO1B1突變，以錯(cuò)義突變和無義突變?yōu)橹?。目前?bào)道的SLCO1B3基因突變僅5種，均為錯(cuò)義突變。

Rotor綜合征以間歇性黃疸為主要臨床表現(xiàn)，本例患兒出生后3 d起病，因反復(fù)皮膚及鞏膜黃染11年入院，實(shí)驗(yàn)室檢查示高膽紅素血癥，直接、間接膽紅素雙向增高?；蚝Y查檢出了SLCO1B1基因的一個(gè)純合變異：c.1738 C>T(p.580R>X)，使蛋白的第580位氨基酸密碼子由精氨酸(Arg，R)密碼子變?yōu)榻K止密碼子。該變異已有文獻(xiàn)報(bào)道，被SNP數(shù)據(jù)庫收錄(rs71581941)，SNP數(shù)據(jù)庫中等位基因T的分布率為0.0051，千人基因組中等位基因T在北京漢族和南方漢族的分布率分別為0和0.02。此變異使蛋白合成提前終止，推測造成蛋白功能喪失?；純哼€被檢出SLCO1B3基因的一個(gè)純合變異：c.360_481 del，蛋白編碼區(qū)的第360至481位堿基缺失。該變異未見文獻(xiàn)報(bào)道，也未見SNP數(shù)據(jù)庫收錄。此變異使蛋白缺失40個(gè)氨基酸的同時(shí)還造成開放閱讀框移碼，可能造成蛋白功能喪失。因此，SLCO1B1和SLCO1B3基因兩個(gè)純合突變引起的溶質(zhì)載體有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白家族OATP1B1和OATP1B3功能缺陷應(yīng)該是本例患兒Rotor綜合征發(fā)病的分子機(jī)制。

本例患兒同時(shí)被檢出了UGT1A1基因的一個(gè)雜合變異：[c.1091C>T，p.364P>L]，使蛋白的第364位氨基酸由脯氨酸(Pro，P)變?yōu)榱涟彼?Leu，L)。該變異已被SNP數(shù)據(jù)庫收錄(rs34946978)，SNP數(shù)據(jù)庫中等位基因T的分布率為0.0046，千人基因組中等位基因T在北京漢族和南方漢族的分布率分別為0.0258和0.025。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測其有害，目前尚無功能或臨床研究證實(shí)其致病可靠性。UGT1A1基因的純合或復(fù)合雜合突變可能導(dǎo)致以間接膽紅素增高為主的遺傳Crigler-Najjar綜合征1型(OMIM：218800)或Crigler-Najjar綜合征2型(OMIM：606785)；UGT1A1基因的雜合、純合或復(fù)合雜合突變都可能導(dǎo)致Gilbert綜合征(OMIM：143500)[6]。

Rotor綜合征在臨床上極為罕見，發(fā)病率未知，預(yù)

后良好，無需特殊治療。臨床上主要表現(xiàn)為黃疸，一般無其他癥狀，易與其他黃疸性疾病混淆[7]。以往診斷主要是在排除感染性肝炎及梗阻性黃疸后，依靠肝臟穿刺檢查發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)無特異色素顆粒沉著，從而與遺傳性結(jié)合膽紅素增高Ⅰ型(Dubin-Johnson綜合征)鑒別。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，SLCO1B1和SLCO1B3基因突變分析可以作為該病的主要確診方法。

[1]Lee WS, McKiernan PJ, Beath SV, et al. Bile bilirubin pigment analysis in disorders of bilirubin metabolism in early infancy. Arch Dis Child, 2001, 85:38-42.

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[3]van de Steeg E, Stráneck V, Hartmannová H, et al. Complete OATP1B1 and OATP1B3 deficiency causes human Rotor syndrome by interrupting conjugated bilirubin reuptake into the liver. J Clin Invest, 2012, 122:519-528.

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[6]Watchko JF. Genetics and pediatric unconjugated hyperbilirubinemia. J Pediatr, 2013,162:1092-1094.

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(本文編輯：錢燕)

SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations in a Chinese boy with Rotor syndrome: a case report

ZHANGZhi-hua,ZHENGBi-xia,LIMei,JINYu,LINQian.

NanjingChildren'sHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,ChinaCorrespondingauthor:LINQian,Email:j_inc@126.com

ObjectiveTo investigate the SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations and clinical features in a Chinese patient with Rotor syndrome. MethodsThe clinical data of the patient was collected. Genomic DNA was extracted from peripheral white blood cells and subjected for second-generation sequencing to screen 4000 known genes for single genetic diseases. Then the detected mutations were confirmed by Sanger sequencing analysis. ResultsThe main clinical manifestations were recurrent yellowish skin and sclera. Laboratory examinations showed as hyperbilirubinemia with both direct and indirect bilirubin elevating. SLCO1B1 gene c.1738 C>T homozygous mutation and SLCO1B3 gene c.360_481 del homozygous mutation were found by high throughput sequencing. C.1738 C>T mutation, a nonsense mutation reported in references, was speculated to causes the conversion of 580th amino acid codons from arginine to a stop codon in protein. And C.360_481 del mutation was a frameshift mutation that caused the nucleotide deletion from 360 th to 481 th in the protein coding region, but it was neither reported in the references nor recorded in SNP database. The frameshift caused deletion of 40 amino acids and code shifting of open reading frame, which might lead to the protein function loss. ConclusionSLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations result in dysfunction of organic anion transporting polypeptide OATP1B and OATP1B3, which is the molecular genetics foundation in the case of Rotor syndrome. This is the first report of Rotor syndrome with SLCO1B1 and SLCO1B3 gene mutations analysis in Chinese population.

Rotor syndrome；SLCO1B1 gene；SLCO1B3 gene

2016-02-03)

210008南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京兒童醫(yī)院消化科

林謙，Email：j_inc@126.com