金宇霆　張江　武昊宇　夏強

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細胞周期激酶亞單位1對肝細胞癌細胞增殖能力的影響

金宇霆張江武昊宇夏強

目的觀察細胞周期激酶亞單位1(CKS1)在肝細胞癌及正常肝組織中的表達以及其對人肝細胞癌細胞BEL-7405的增殖能力的影響。方法應用免疫組織化學檢測65對手術肝細胞癌組織及癌旁正常組織CKS1的表達水平。應用Western印跡檢測肝癌細胞系與正常肝臟細胞中CKS1表達量的差異。應用小干擾RNA(siRNA)技術轉染肝細胞癌BEL-7405細胞，Western印跡檢測CKS1 siRNA對CKS1蛋白的干擾效果，同時應用細胞計數試劑盒(CCK-8)和平板克隆增殖實驗檢測CKS1對BEL-7405細胞增殖能力的影響。結果免疫組織化學染色結果顯示，CKS1在正常肝組織中表達量較肝細胞癌組織中表達量低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western印跡檢測表明CKS1在7種肝細胞癌細胞系表達量顯著高于正常肝細胞株，且CKS1的表達量在肝細胞癌BEL-7405細胞株顯著高于其他肝癌細胞株。CCK-8法檢測CKS1的siRNA轉染BEL-7405細胞與陰性對照組和空白對照組相比明顯抑制細胞增殖，在48、72和96 hA值分別降低了0.376、0.566、0.972(P<0.05)；平板克隆增殖形成實驗表明，CKS1的siRNA轉染BEL-7405細胞后腫瘤細胞形成的克隆增殖集落明顯少于陰性對照組和空白組,干擾組與空白、陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論CKS1在肝細胞癌組織中表達量顯著高于正常肝組織，在肝癌細胞中表達量顯著高于正常肝細胞， CKS1在肝細胞癌細胞BEL-7405的增殖中扮演了重要的角色，CKS1可能成為針對肝細胞癌基因治療的新興靶點。

肝細胞癌； 細胞周期激酶亞單位1； siRNA干擾；細胞增殖

研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期紊亂密切相關，細胞周期激酶亞單位(Cyclin kinase subunit，CKS)家族蛋白是真核生物在進化中相對保守的小分子蛋白，高等真核生物表達CKS1和CKS2兩種蛋白，該蛋白與細胞周期功能相關[1]。CKS家族蛋白通過影響S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的活性，導致腫瘤抑制蛋白p27泛素化，結合CKS1蛋白促進增殖分化、抗凋亡[2-5]，可能也參與了惡性腫瘤的發(fā)生、進展過程。本研究采用免疫組織化學技術和Western印跡法檢測HCC組織和細胞與正常肝臟組織和肝細胞的表達分布，同時應用體外化學合成的CKS1 siRNA轉染人HCC細胞BEL-7405，探討其對HCC增殖能力的影響及其作用機制。

資料和方法

一、主要材料和試劑

HCC組織取自上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院肝臟外科2013年3月至2014年2月手術切除HCC標本共65對，包括HCC組織，以及癌旁肝臟組織(距癌組織邊緣2 cm)。65例HCC患者中男43例，女22例，年齡36～69歲，中位年齡49歲。所有標本經2名病理科資深醫(yī)師證實為原發(fā)性HCC，患者均簽署知情同意書，術前均未接受放療、化療和其他藥物治療。兔抗人CKS1抗體購自美國Abcam公司，人HCC細胞株HepG2、QGY-7703、BEL-7405、SMMC-7721、PLC、MHCC-97L、MHCC-97H以及人正常肝臟細胞株HL-7702購自中國科學院細胞庫，DMEM培養(yǎng)液(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，siRNA-CKS1質粒(上海吉瑪公司)，GAPDH抗體購自美國Santa-cruz公司，蛋白提取試劑盒購自北京普利萊公司。

二、方法

(一) 免疫組織化學檢測脫蠟水化；抗原修復；封閉內源性過氧化物酶，滴加一抗，CKS1抗體(1∶100)；滴加聚合物增強劑(試劑A)，滴加酶抗鼠/兔聚合物(試劑B)，DAB顯色；蘇木素復染、返藍；脫水透明，樹膠封片；結果判定標準：陽性細胞為淺黃或棕褐色；陽性細胞數>5%判為陽性。

(二) 細胞培養(yǎng)及分組人HCC細胞株HepG2、QGY-7703、BEL-7405、SMMC-7721、PLC、MHCC-97L、MHCC-97H以及人正常肝臟細胞株HL-7702均用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃，體積分數為0.05的CO2孵箱培養(yǎng)。3組分別為干擾組、陰性對照組和空白組，實驗所有指標的檢測均按照以下分組：CKS1 siRNA組、陰性對照組(NC),空白對照組。

(三) siRNA轉染BEL-7405細胞處于50%～70%融合時CKS1 siRNA、NC組分別轉染，并嚴格按照LipofectamineTM2000(美國Invitrogene公司)轉染試劑盒說明書操作。并取對數生長期細胞進行實驗。

(四) Western印跡檢測腫瘤細胞和正常肝癌細胞HL-7702的CKS1蛋白表達水平以及BEL-7405細胞質粒干擾后CKS1蛋白的表達水平提取總蛋白；加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸變性；通過分離，轉至硝酸纖維素膜上，加入一抗CKS1和GAPDH抗體，4℃孵育過夜；加入二抗，室溫下孵育2 h；然后用奧德賽紅外激光成像系統(tǒng)掃描條帶顯色。結果用Image J進行灰度值分析。

(五)細胞計數試劑盒(CCK-8)檢測BEL-7405細胞增殖取轉染后細胞，每孔鋪2×107/L細胞、每組設5個復孔，每孔加含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基200 μL；置于37℃、體積分數為0.05的CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48、72、96 h ；每復孔加入無血清培養(yǎng)基100 μL，CCK-8溶液10 μL，空白對照孔只加等量無血清培養(yǎng)基和CCK-8溶液；放入培養(yǎng)液繼續(xù)孵育0.5、1.0、2.0、4.0 h；酶標儀測定450 nm波長下的吸光度(A)值。

(六)克隆形成實驗野生BEL-7405細胞，siRNA干擾BEL-7405細胞，NC處理BEl-7405細胞接種到6孔板，每個孔1×1 000個細胞，培養(yǎng)10 d。細胞克隆與10%甲醛混合10 min，用1.0%龍膽紫染色5 min。數碼相機拍照，計數克隆數目(>50個細胞/克隆)。

三、統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結　　果

一、免疫組織化學檢測CKS1在HCC癌組織以及癌旁組織中的表達情況

CKS1的表達量在癌旁組織及HCC癌組織中均有表達，而在HCC癌組織中表達量顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=26.365,P<0.05)。見表1，圖1。

二、Western印跡檢測CKS1蛋白在不同HCC細胞株及正常肝細胞株中的表達

CKS1在不同HCC細胞株中的表達量不一致，但均高于正常肝臟細胞HL-7702，其中CKS1蛋白在BEL-7405細胞中的表達量最高(圖2)。

注：A. HCC癌旁組織；B. 肝細胞癌組織

組別份數陽性(+)中等陽性(++)強陽性(+++)HCC癌旁組織65321815HCC癌組織 65141635

注：CKS1為細胞周期激酶亞單位1

注：CKS1為細胞周期激酶亞單位1。1～7為HCC細胞系：7703，7721，HepG2，7405，PLC，97L，97H；8為人正常肝細胞株7702

圖2Western印跡檢測CKS1在HCC及人正常肝臟細胞株中表達

三、siRNA干擾BEL-7405細胞之后，CKS1蛋白表達量變化

圖3siRNA干擾BEL-7405細胞后，CKS1蛋白的表達情況

使用siRNA處理BEL-7405細胞株之后，siRNA組的CKS1蛋白表達量相較陰性對照組及空白組下明顯(圖3)，表明siRNA表達載體轉染成功，可明顯注：CKS1為細胞周期激酶亞單位1；Mock為空白對照組；NC為陰性對照組；Knockdown為siRNA敲低組；siRNA敲低組與NC組和MOCK組比較，P<0.05降低CKS1基因的表達水平。

四、CCK-8實驗結果

經CKS1 siRNA處理后，HCC細胞株BEL-7405的增殖能力較空白對照組和NC組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

五、克隆平板實驗結果

經CKS1 siRNA處理后，HCC細胞株BEL-7405的克隆增殖形成能力像較空白對照組和NC減少明顯，見圖4。

注：NC為陰性對照組；Knockdown為siRNA敲低組

組別0h24h48h72h96hMock0.312±0.0320.511±0.0411.217±0.0561.575±0.0682.211±0.088NC0.321±0.0270.532±0.0371.257±0.0621.622±0.0712.575±0.104Knockdown0.299±0.0460.431±0.0290.875±0.0421.025±0.0531.212±0.071

注：Mock為空白對照組；NC為陰性對照組；Knockdown為siRNA敲低組。siRNA敲低組與NC組和MOCK組比較，P<0.05

討　　論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細胞周期紊亂密切相關，細胞周期調控的核心是一組細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases，CDK)[6，7]。CDK的時相性激活與失活分別受到細胞周期蛋白和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin dependent kinase inhibitors，CKI)的調控。p27kip1蛋白即是屬于CKI中的一種，它可通過抑制Cyclin-Cdk/CDK的活性來調控細胞周期[8，9]。p27kip1在原發(fā)性肝癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤中呈低表達狀態(tài)，而且與腫瘤的惡性程度和預后相關。CKS1是高度保守的細胞周期調節(jié)蛋白，CkS家族蛋白通過S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2,Skp2)的活性，使腫瘤抑制蛋白p27泛素化，導致腫瘤抑制蛋白p27活性產生變化，導致其抑癌作用變化，從而促進腫瘤細胞增殖分化、使其凋亡下降[10]。

本研究結果顯示，CKS1蛋白在HCC中表達并定位于細胞核，在HCC癌組織中其表達量明顯高于癌旁組織。Western印跡實驗進一步在細胞水平驗證了相似的結果，CKS1蛋白在肝細胞癌細胞系中表達量顯著高于正常肝細胞。因此，推測CKS1在HCC腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色。通過Western印跡技術檢測其干擾效率，結果顯示siRNA有效干擾了CKS1基因的表達。采用CCK-8法檢測，發(fā)現siRNA干擾后的細胞株的增殖能力明顯下降，而陰性對照組和空白對照組間差距不大，且顯著高于干擾組?？寺∑桨逍纬蓪嶒炞C實，siRNA干擾處理之后的BEL-7405細胞克隆增殖集落形成能力顯著低于陰性對照組及空白對照組。這也從細胞功能層面上證實了下調CKS1基因之后，細胞增殖能力產生了顯著下降。

本研究表明，CKS1基因顯著高表達于HCC腫瘤組織中，同時促進HCC細胞株BEL-7405的增殖能力，同時應用siRNA干擾技術可有效抑制CKS1基因的表達，使細胞增殖能力顯著降低。為HCC發(fā)病的基因學研究提供了新的思路。

[1]Kim JY, Kim HJ, Park JH, et al. Epidermal growth factor upregulates Skp2/Cks1 and p27(kip1) in human extrahepatic cholangiocarcinoma cells. World J Gastroenterol，2014，20:755-773.

[2]Khattar V, Thottassery JV. Cks1: Structure, Emerging Roles and Implications in Multiple Cancers. J Cancer Ther， 2013，4:1341-1354.

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(本文編輯：錢燕)

Effect of cyclin dependent kinase submit 1 on proliferation of hepatocellular carcinoma(HCC) BEL-7405 cells

JINYu-ting,ZHANGJiang,WUHao-yu,XIAQiang.

Desect1mentofLiverSurgery,RenJiHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200127,ChinaCorrespondingauthor:XIAQiang,Email:xiaqiang@medmail.com.cn

ObjectiveTo investigate the expression of cyclin dependent kinase submit 1 (CKS1) in hepatocellular carcinoma (HCC) and its effect on the proliferation of HCC cell line, BEL-7405. MethodsThe expression of CKS1 in 65 pairs of HCC tissues and normal tissues was measured by immunohistochemistry (IHC). Meanwhile, the expression of CKS1 in 7 different HCC cell lines and normal liver cell line was analyzed by western blot. Furthermore, a small interfering RNA (siRNA) targeting CKS1 was constructed and transfected into human HCC cells BEL-7405. The effects of CKS1 knockdown on cell proliferation and gene expression were assessed by CCK-8 assay, tablet cloning assay and western blot analysis, respectively. ResultsCKS1 expression was extremely higher in HCC tissue than that in normal liver tissue (P<0.05). Proliferation of siRNA-transfected BEl-7405 cells (siRNA-transfected group) was extremely inhibited comparing to that of negative control or blank group (P<0.05). ConclusionThe expression of CKS1 in HCC tissues and cell lines was significantly higher than that normal liver tissue or cell line, respectively. Additionally, CKS1 plays an important role in proliferation of BEL-7405 HCC cell lines, which might be a novel anti-tumor target for HCC.

HCC; CKS1; siRNA; Cell proliferation

2016-03-02)

國家自然基金項目(81472243)

200127上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院肝臟外科

夏強，Email：xiaqiang@medmail.com.cn