張秀芳　孫　瑩　趙　丹　白小雪　魏　靜　華樹成

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院呼吸科，吉林　長春　130021)

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MEF2D在肺癌中的表達(dá)及其在肺癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移中的作用

張秀芳孫瑩趙丹白小雪魏靜華樹成

(吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院呼吸科，吉林長春130021)

目的研究MEF2D在肺癌中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。方法收集30例肺癌組織標(biāo)本，通過qPCR實驗、蛋白免疫印跡實驗和細(xì)胞免疫熒光實驗檢測MEF2D在肺癌組織和肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)；通過細(xì)胞增殖實驗和Transwell實驗觀察在敲除和過表達(dá)MEF2D后，肺癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果與癌周正常組織相比，肺癌組織中MEF2D mRNA表達(dá)水平顯著提高(P<0.01)，肺癌細(xì)胞系(A549、H460、H1229)中MEF2D表達(dá)含量與正常肺成纖維細(xì)胞MRC-5相比含量升高(P<0.01)。與普通肺癌細(xì)胞相比，敲除了MEF2D的肺癌細(xì)胞增殖率下降，細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力降低；與對照組相比，過表達(dá)MEF2D的MRC-5增殖率升高，轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)(P<0.01)。結(jié)論MEF2D在肺癌組織和肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，且能促進(jìn)肺癌的增殖及轉(zhuǎn)移

肺癌；MEF2D；增殖；轉(zhuǎn)移

目前肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制還沒有得到完全闡明，因此臨床治療無法明顯提高肺癌患者生存率。近年來，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子-肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2家族(MEF2)在腫瘤中起著重要的作用。本文擬檢測MEF2D對肺癌細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞增殖、抗凋亡及轉(zhuǎn)移能力的影響，為肺癌的臨床診斷與治療提供理論依據(jù)。

1　材料和方法

1.1實驗細(xì)胞和標(biāo)本來源A549、H460、H1229肺癌細(xì)胞和正常肺成纖維細(xì)胞MRC-5、人皮膚成纖維細(xì)胞BJ購買于American Type Culture Collection(ATCC)。全部細(xì)胞株均按照說明書推薦條件下，培養(yǎng)在37℃和5%CO2環(huán)境中，培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基。收集2012年8月至2014年8月吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院住院肺癌患者30例，將手術(shù)切下的肺癌及癌周組織放置于-80℃冰箱待用。

1.2主要試劑和儀器MEF2D 一抗、FITC 標(biāo)記二抗：BD公司；對照質(zhì)粒pcDNA-GFP：Addgene；CFX96 實時熒光定量檢測系統(tǒng)：Bio-Rad Laboratories；TaqMan?2×Universal PCR Master Mix 試劑：Applied Biosystems；Trizol:Invitrogen；Rever Tra Ace qPCR RT 試劑盒：日本東洋；Mammalian Protein Extraction Reagent：Thermo；GAPDH 一抗：CST公司；Scepter Handheld Automated：Millipore；ChemiDox XRS imaging system：Bio-RAD；FITC標(biāo)記的 Annexin V/PI凋亡染色試劑盒：BioVision；流式細(xì)胞儀(FACS Aria II Cell Sorter)：BD公司。

1.3實驗方法

1.3.1細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記分別將2×104個A549細(xì)胞和2×104個MRC-5細(xì)胞在小玻璃片上培養(yǎng)24 h，用70%的酒精固定1 h。依次加入 MEF2D 抗體(1∶200)和 FITC 標(biāo)記二抗(稀釋濃度為1∶5 000)，DAPI(1∶10 000)染核。利用免疫熒光顯微鏡觀察熒光的顯色情況。Image J 軟件進(jìn)行熒光定量。

1.3.2實時定量PCR按照制造商提供的操作流程用Trizol提取RNA,應(yīng)用 Rever Tra Ace qPCR RT試劑盒，參照制造商提供的操作流程將得到的RNA分子反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。應(yīng)用TaqMan?2 × Universal PCR Master Mix 試劑及 CFX96TM實時 PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad Laboratories,CA)進(jìn)行qPCR檢測。

1.3.3蛋白免疫印跡實驗用M-PER試劑盒提取總蛋白，將獲得的總蛋白用SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)膜到0.45 μm硝酸纖維醋膜上，用含有5%BSA的PBS封閉后，分別用MEF2D 一抗(1∶1 000)和GAPDH 一抗(1∶2 000)孵育，接著用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育硝酸纖維醋膜，最后在顯像系統(tǒng)(ChemiDox XRS imaging system)下顯像蛋白條帶。

1.3.4細(xì)胞增殖能力檢測siMEF2D 和對照組siRNA分別轉(zhuǎn)染3×103個A549肺癌細(xì)胞和3×103個H460肺癌細(xì)胞，pcDNA-MEF2D 和對照組pcDNA-GFP分別轉(zhuǎn)染3×103個MRC-5正常肺成纖維細(xì)胞，所有細(xì)胞接種在96孔板中。經(jīng)過特定時間后用Scepter Handheld Automated計數(shù)法來檢測各孔的細(xì)胞數(shù)目。

1.3.5細(xì)胞凋亡能力檢測將2×105個A549，H460和 MRC-5細(xì)胞分別種在6孔板中，用慢病毒MEF2D載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后，按照試劑廠家推薦步驟用FITC標(biāo)記的 Annexin V/PI染色細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡狀況。

1.3.6細(xì)胞侵襲能力(Transwell實驗)檢測將各1×103個已經(jīng)轉(zhuǎn)染過MEF2D siRNA 或 pcDNA-MEF2D的A549、H460、 MRC-5細(xì)胞和相應(yīng)的對照組細(xì)胞種植在預(yù)先處理的Matrigel膠上，然后分別用 300 μl 和 200 μl培養(yǎng)基加入小室下方和上方。 24 h后，用0.1%的結(jié)晶紫染色，經(jīng)過漂洗干燥，于顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。計數(shù)隨機(jī)選取10個區(qū)域(×200)的浸潤細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗或方差分析。

2　結(jié)　果

2.1MEF2D在肺癌中過表達(dá)通過qPCR來檢測MEF2家族成員MEF2A、2B、2C和2D在肺癌組織(n=30)中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺部組織(1.0±0.22)相比，肺癌組織中的MEF2D mRNA表達(dá)量(2.1±0.55)顯著提高(P=1.88×10-5)。肺癌組織中MEF2A mRNA和MEF2C mRNA的表達(dá)含量(1.2±0.41，1.0±0.34)與正常肺部組織(1.0±0.36，1.0±0.32)相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.352、P=0.189)。肺癌組織和正常肺部組織中沒有檢測到MEF2B的表達(dá)。Western印跡實驗進(jìn)一步驗證了在肺癌組織和A549、H460、H1229肺癌細(xì)胞中，MEF2D的表達(dá)水平明顯高于正常肺部組織和正常肺成纖維細(xì)胞(圖1A)。免疫熒光染色實驗發(fā)現(xiàn)MEF2D主要定位在A549細(xì)胞核內(nèi)，正常的肺成纖維細(xì)胞中，MEF2D主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖1B)。

圖1　MEF2D在肺癌中過表達(dá)

2.2過表達(dá)MEF2D對正常肺部細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響見圖2。為了進(jìn)一步了解MEF2D的生物學(xué)行為，將表達(dá)MEF2D的質(zhì)粒(pcDNA-MEF2D)轉(zhuǎn)染入正常肺纖維母細(xì)胞MRC-5中，使MEF2D 在MRC-5細(xì)胞過高表達(dá)，蛋白免疫印跡實驗進(jìn)一步驗證轉(zhuǎn)染pcDNA-MEF2D 的MRC-5細(xì)胞MEF2D的表達(dá)水平與對照組相比升高(圖2A)。增殖實驗檢測高表達(dá)MEF2D的MRC-5細(xì)胞的增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)染GFP的對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-MEF2D 的MRC-5細(xì)胞增殖率升高(圖2B)。另外，Transwell實驗進(jìn)一步提示高表達(dá)MEF2D 的MRC-5細(xì)胞，侵襲能力與對照組相比增高(圖2C)。BrdU 實驗 和 ki67檢測也提示在正常肺成纖維細(xì)胞MRC-5中 MEF2D過表達(dá)其增殖率也增加(圖2A和2D)。

2.3敲除MEF2D對肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響靶向針對MEF2D的 siRNA(MEF2D siRNA)分別轉(zhuǎn)染A549肺癌細(xì)胞和 H460肺癌細(xì)胞，來敲除A549肺癌細(xì)胞和 H460肺癌細(xì)胞中的MEF2D，蛋白免疫印跡實驗進(jìn)一步驗證敲除了MEF2D的A549肺癌細(xì)胞和 H460肺癌細(xì)胞與對照組相比MEF2D表達(dá)水平下降(圖3A)。同時對該敲除MEF2D的A549肺癌細(xì)胞和 H460肺癌細(xì)胞進(jìn)行增殖能力的檢測，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比其增殖率都有所降低(圖3B)。另外，與對照組相比兩種細(xì)胞凋亡率同時也增高(圖3C)。Transwell實驗進(jìn)一步證明了敲除掉MEF2D后，A549、H460肺癌細(xì)胞侵襲能力與對照組相比降低(圖3D)。 敲除MEF2D的A549、H460肺癌細(xì)胞與對照組相比增殖率降低(圖3E)。以上所有的實驗結(jié)果都證明抑制MEF2D表達(dá)能夠減少肺癌細(xì)胞的增殖以及轉(zhuǎn)移。

圖2　過表達(dá)MEF2D對正常肺部細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

圖3　敲除MEF2D對肺癌增殖、存活和轉(zhuǎn)移的影響

3　討　論

MEF2屬于轉(zhuǎn)錄因子MADS-box調(diào)節(jié)家族，最早發(fā)現(xiàn)于骨骼肌管的一種蛋白質(zhì)，在脊椎動物中，MEF2家族包括了MEF2A、MEF2B.MEF2C和MEF2D四個成員〔1〕。已有研究表明，MEF2C和 MEF2D能分別促進(jìn)VEGF信號通路的活化及增加細(xì)胞增殖能力，對肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展中具有非常重要的意義〔2，3〕。另有研究闡明，HCC的侵襲以及轉(zhuǎn)移能力增加是由于MEF2蛋白表達(dá)的加強(qiáng)，增加TGF-β1的表達(dá)來完成這種作用的〔4〕。MEF2家族除了在實體腫瘤中的作用，白血病的發(fā)生中也被證明與其有聯(lián)系〔5～7〕。另外，Zhao等〔8〕提出，一種抑制細(xì)胞活性的天然抗菌素混合物齊墩果酸，能夠在肺癌細(xì)胞中促進(jìn)miR-122的產(chǎn)生，的并能夠抑制miR-122的下游靶點 CCNG1 和 MEF2D的表達(dá)。這個發(fā)現(xiàn)意味著MEF2家族可能和肺癌存在著某些聯(lián)系。

但是到目前為止，仍然缺乏有效的實驗證據(jù)來明確這種聯(lián)系。在本研究中，MEF2D主要定位于肺癌細(xì)胞系的細(xì)胞核內(nèi)，這進(jìn)一步表明MEF2D在肺癌中是異常高表達(dá)的。另外，已有較多的證據(jù)表明，在神經(jīng)元細(xì)胞中MEF2D促進(jìn)細(xì)胞存活〔9～11〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達(dá)MEF2D的肺癌細(xì)胞其增殖與轉(zhuǎn)移能力是降低的。另外在過表達(dá)MEF2D的正常肺成纖維細(xì)胞中，細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移能力卻是增加的。從而提示我們MEF2D在肺癌中高表達(dá)，且能夠促進(jìn)肺癌的增殖與轉(zhuǎn)移。

本研究首次證明了MEF2D在肺癌中的抗凋亡作用，這為靶向針對MEF2家族成員轉(zhuǎn)錄因子的肺癌治療提供了新的理論依據(jù)。MEF2D在肺癌組織中高表達(dá)，且能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，提示MEF2D有可能成為肺癌治療的又一靶點，靶向針對MEF2家族成員轉(zhuǎn)錄因子治療有可能成為肺癌治療的新方向。但是MEF2D在肺癌中抗凋亡的具體分子機(jī)制還需要我們進(jìn)一步的探索。

1程波，李利，王林杰，等.MEF2 基因家族的研究進(jìn)展〔J〕.中國畜牧雜志,2012;48(15):70-4.

2Bai XL,Zhang Q,Ye LY,etal.Myocyte enhancer factor 2C regulation of hepatocellular carcinoma via vascular endothelial growth factor and Wnt/beta-catenin signaling〔J〕.Oncogene,2014;34(31):4089-97.

3Ma L,Liu J,Liu L,etal.Overexpression of the transcription factor MEF2D in hepatocellular carcinoma sustains malignant character by suppressing G2-M transition genes〔J〕.Cancer Res,2014;74(5):1452-62.

4Yu W,Huang C,Wang Q,etal.MEF2 transcription factors promotes EMT and invasiveness of hepatocellular carcinoma through TGF-beta1 autoregulation circuitry〔J〕.Tumour Biol,2014;35(11):10943-51.

5Cante-Barrett K,Pieters R,Meijerink JP.Myocyte enhancer factor 2C in hematopoiesis and leukemia〔J〕.Oncogene,2014;33(4):403-10.

6Lilljebjorn H,Agerstam H,Orsmark-Pietras C,etal.RNA-seq identifies clinically relevant fusion genes in leukemia including a novel MEF2D/CSF1R fusion responsive to imatinib〔J〕.Leukemia,2014;28(4):977-9.

7Prima V,Hunger SP.Cooperative transformation by MEF2D/DAZAP1 and DAZAP1/MEF2D fusion proteins generated by the variant t(1;19)in acute lymphoblastic leukemia〔J〕.Leukemia,2007;21(12):2470-5.

8Zhao X,Liu M,Li D.Oleanolic acid suppresses the proliferation of lung carcinoma cells by miR-122/Cyclin G1/MEF2D axis〔J〕.Mol and Cell Biochem,2015;400(1-2):1-7.

9Ma L,Liu J,Shen J,etal.Expression of miR-122 mediated by adenoviral vector induces apoptosis and cell cycle arrest of cancer cells〔J〕.Cancer Biol Ther,2010;9(7):554-61.

10Davidson MR,Larsen JE,Yang IA,etal.MicroRNA-218 is deleted and downregulated in lung squamous cell carcinoma〔J〕.PloS One,2010;5(9):e12560.

11Sher YP,Wang LJ,Chuang LL,etal.ADAM9 up-regulates N-cadherin via miR-218 suppression in lung adenocarcinoma cells〔J〕.PloS One,2014;9(8):e94065.

〔2015-12-31修回〕

(編輯李相軍)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.020

華樹成(1961-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事呼吸系統(tǒng)的病毒感染、炎癥與防御反應(yīng)研究。

張秀芳(1989-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)的病毒感染、炎癥與防御反應(yīng)研究。

R562.2

A

1005-9202(2016)14-3397-04；