劉　有，張曉歡，白　劍，張麗萍，王學良

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肝纖維化模型中小鼠肝臟的病理變化及軟肝沖劑的治療作用

劉有1，張曉歡1，白劍2,3*，張麗萍2，王學良2

1.解放軍總醫(yī)院海南分院，三亞572000；2.遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽110847；3.中國人民解放軍第三〇九醫(yī)院器官移植研究，北京100091

[摘要]目的觀察肝纖維化模型中小鼠肝臟的病理改變以及軟肝沖劑對小鼠肝纖維化模型的治療作用。方法將60只雄性SPF級C57B/L小鼠隨機分為空白對照組、模型組、護肝片對照組、軟肝沖劑低劑量組和軟肝沖劑高劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M給予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；護肝片對照組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予護肝片0.1 mg/(kg·d)灌胃至第10周；軟肝沖劑低劑量組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予軟肝沖劑1 g/(kg·d)灌胃至第10周；軟肝沖劑高劑量組給藥劑量為5 g/(kg·d)，造模及給藥方法與低劑量組相同。在第10周通過摘除眼球取血，檢測小鼠血清中的透明質酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、三型前膠原(PCⅢ)、四型膠原(Ⅳ-C)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)；檢測肝臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的含量；計算肝臟指數(shù)；觀察小鼠肝臟的HE染色和MASSON染色病理組織學改變。結果模型組與空白對照組比較，小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST水平顯著升高(P<0.05)，肝臟組織中SOD顯著降低(P<0.05)，MDA顯著升高(P<0.05)，肝臟指數(shù)增加(P<0.05)，病理切片顯示肝細胞壞死并出現(xiàn)脂肪空泡、纖維組織增生和炎細胞浸潤，MASSON染色顯示肝組織內出現(xiàn)明顯脂肪空泡和纖維組織增生；軟肝沖劑組與模型組比較，小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的水平顯著降低(P<0.05)，肝臟組織中SOD顯著升高(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，肝臟指數(shù)降低(P<0.05)，病理檢查顯示肝臟組織中無炎性浸潤、脂肪空泡和纖維組織沉積，MASSON染色顯示肝組織內出現(xiàn)明顯脂肪空泡和纖維組織增生。結論CCl4腹腔注射可以形成小鼠肝硬化模型，病理改變以脂肪空泡出現(xiàn)和纖維化為主；軟肝沖劑可以改善肝臟功能，減輕CCl4誘導小鼠肝纖維化程度。

[關鍵詞]軟肝沖劑；肝纖維化；SOD；MDA

0　引言

肝纖維化是多種慢性肝臟疾病發(fā)展到一定階段的共同特征，從病理學角度上看，肝纖維化是肝細胞基質(Extra-cellular matrix，ECM)代謝異常，表現(xiàn)為ECM的合成增多而分解減少，最終導致其大量沉積的過程[1]。目前，中醫(yī)藥在我國已經被廣泛應用于治療慢性肝炎和肝硬化，臨床實踐證明，中醫(yī)藥在治療肝纖維化領域中確實有獨到之處，并取得了較好的療效[2-4]。軟肝沖劑是遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院的一種院內制劑，試劑是在繼承已故全國名老中醫(yī)、肝病專家王文彥教授的肝纖維化發(fā)病中心環(huán)節(jié)為“脾虛肝郁”，其他血瘀、水停皆由此產生的學術思想的基礎上，并根據(jù)其經驗方軟肝煎通過現(xiàn)代制劑技術制成，對于肝硬化患者具有明確的治療作用[5]。本實驗在此基礎上，采用CCl4腹腔注射的方法制作肝纖維化模型，觀察肝臟的病理改變，并觀察軟肝沖劑對肝纖維化小鼠模型的治療機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物和主要儀器C57B/L小鼠60只，體重(20±1)g，4～5周齡，由遼寧長生生物技術有限公司提供，動物許可證號:SYXK(遼)2010-0001。TBA-40FR全自動生化檢測儀購自日本東芝公司；BS14-F8超細勻漿器購自成都一科儀器設備有限公司。

1.2試劑水合氯醛和CCl4均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；花生油為魯花牌花生油；HA(貨號:9063-50)、LN(貨號:9074-50)、PCⅢ(貨號:9071A-50)、Ⅳ-C ELISA(貨號:9071C-50)檢測試劑盒購自上海研晶生物科技有限公司；ALT(貨號:20141129)和AST(貨號:20141011)檢測試劑購于四川邁克生物科技有限公司；SOD(A001-2)與MDA(A003-2)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；軟肝沖劑購自遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院制劑室。

1.3實驗分組和動物模型的制備取60只C57B/L小鼠,隨機分為空白對照組、模型組、護肝片對照組、軟肝沖劑低劑量組和軟肝沖劑高劑量組，每組12只?？瞻讓φ战M給予100%花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；模型組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周；護肝片對照組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予護肝片0.1 mg/(kg·d)灌胃至第10周；軟肝沖劑低劑量組給予含20% CCl4的花生油1 mL/kg腹腔注射，每周2次，共10周，并從第3周起給予軟肝沖劑1 g/(kg·d)灌胃至第10周；軟肝沖劑高劑量組給藥劑量為5 g/(kg·d)，造模及給藥方法與低劑量組相同。

1.4病理學及血清指標檢測在第10周通過摘除眼球取血，不抗凝，離心分離血清，通過721分光光度計，檢測小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C的含量；通過TBA-40FR全自動血液生化分析檢測ALT和AST的含量；計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝臟的重量/小鼠的重量；留取肝臟約0.5 g勻漿，用生理鹽水沖掉殘留血液，在勻漿器加入生理鹽水，將肝組織研磨成0.5%、1%和10%的混懸液，在4 000 r/min離心15 min，通過721分光光度計，檢測小鼠肝組織內SOD和MDA的活性；將剩余肝臟組織浸泡于5%的福爾馬林溶液中固定，使用HE和MASSON染色，觀察小鼠肝臟的病理組織學改變和纖維組織沉積情況。

2　結果

2.1軟肝沖劑對CCl4肝纖維化小鼠肝臟病理變化的影響空白對照組小鼠肝細胞體積較大，呈多面體形，核大而圓，核膜完整，位于細胞中央；肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，板間為不規(guī)則的肝竇；肝細胞間連接緊密。模型組小鼠肝小葉界限不清，胞質內可見多個大小不等的脂肪空泡；出現(xiàn)炎性細胞浸潤；肝細胞索排列紊亂；肝竇變窄。護肝片對照組和軟肝沖劑低劑量組肝組織結構有所改善，肝細胞脂肪變性減輕，但仍有炎性細胞浸潤與假小葉形成。軟肝沖劑高劑量組肝組織結構有較明顯改善，肝細胞脂肪變性顯著減輕，未見炎性細胞浸潤與假小葉形成。見圖1、圖2。

圖1　各組小鼠肝臟HE切片(×200)

2.2軟肝沖劑對CCl4肝纖維化小鼠肝臟指數(shù)的影響空白對照組與模型組肝臟指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義，表明造模成功；護肝片對照組、軟肝沖劑組與模型組肝臟指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明軟肝沖劑對改善肝纖維化有作用。見表1。

圖2　各組小鼠肝臟MASSON染色(×200)

組別肝臟體重(g)小鼠體重(g)肝臟指數(shù)(%)空白對照組0.63±0.2221.46±1.953.0±0.7*模型組0.94±0.4419.22±1.914.2±1.1護肝片對照組0.75±0.1321.09±1.983.5±0.4*軟肝沖劑低劑量組0.68±0.1221.14±2.153.4±0.3*軟肝沖劑高劑量組0.71±0.1521.21±2.143.5±0.2*

注：*與模型組比較，P<0.05

2.3軟肝沖劑對CCl4肝纖維化小鼠肝功能指標的影響小鼠經CCl4造模后，與空白對照組比較，小鼠血清中的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量明顯增加，提示肝細胞受損，造模成功(P<0.05)；治療后，護肝片對照組與模型組比較，血生化指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與空白對照組比較，血生化指標差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。軟肝沖劑組與模型組比較，血生化指標差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與空白對照組比較，血生化指標差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　軟肝沖劑對CCl4肝纖維化小鼠血清中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響

注：*與模型組比較，P<0.05；#與空白對照組比較，P<0.05

2.4軟肝沖劑對小鼠肝組織內SOD和MDA的影響結果表明，小鼠造模后與空白對照組比較，血清中SOD水平明顯下降，MDA含量明顯上升，提示肝細胞受損，造模成功(P<0.05)；護肝片對照組與模型組比較，SOD和MDA差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。軟肝沖劑低劑量組與模型組比較，SOD和MDA差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明低劑量軟肝沖劑對肝纖維化具有治療作用。軟肝沖劑高劑量組與模型組比較，SOD和MDA差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義，表明高劑量軟肝沖劑對肝纖維化具有明顯的治療作用。見表3。

表3　軟肝沖劑對小鼠肝組織脂質過氧化損傷的影響

注：*與模型組比較，P<0.05；#與空白對照組比較，P<0.05

3　討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為，肝臟纖維化過程是ECM的異常沉積并釋放入血的過程，而HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C幾乎覆蓋了ECM的全部蛋白成分，因此，上述指標能夠較好地反映肝臟功能[6]。HA由間質細胞合成并在肝臟內皮細胞內代謝，當肝臟功能受損時HA在血液中蓄積，有研究顯示,在肝硬化早期HA明顯增加，HA>60 μg/L對肝硬化早期診斷的敏感性可達90%以上，當肝硬化緩解后，HA下降速度也最快[7]；LN的變化則直接與肝竇毛細血管的結構密切相關，當肝竇毛細血管出現(xiàn)充血和水腫時，LN在血清內的含量明顯增加；PCⅢ是Ⅲ型膠原在體內的前體，而在肝纖維化早期Ⅲ型膠原表達明顯增加；Ⅳ型膠原主要在肝內合成及代謝，是基底膜的重要組分之一，同時也是反映肝纖維化活動性和程度的重要參考指標。ALT可以反映肝細胞的完整程度，AST可以反映線粒體膜的完整程度，當肝細胞膜受損通透性增加時，酶從肝細胞內逸出進入血液，導致血內ALT和AST含量增加，因此二者是診斷肝實質損害的重要依據(jù)之一[8]。同時，本實驗選取了SOD和MDA的活性來判斷肝臟損傷情況。其中MDA是氧化應激常用的標志物，由多不飽和脂肪酸過氧化分解產生，是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，常用來間接反映機體的自由基代謝變化及細胞的損傷程度[9-10]；SOD廣泛存在于需氧有機體中，是一種抗氧化的酶，主要功能是保護肝臟免遭氧化性損傷。

在小鼠的肝纖維化模型形成過程中，上述血清學的指標變化晚于病理改變的發(fā)生，這是由于肝臟具有很強的代償能力，在肝臟失代償前血清學的指標均未發(fā)生明顯變化。當肝臟進入失代償期后，小鼠肝臟發(fā)生相應的病理學改變，包括肝小葉界限不清，胞質內還可見多個大小不等的脂肪空泡；出現(xiàn)炎性細胞浸潤，肝細胞索排列紊亂，肝竇變窄。此時血清學的指標變化逐步顯現(xiàn)。本實驗選用HE和MASSON兩種指標來檢測肝臟的病理變化，發(fā)現(xiàn)當腹腔注射CCl4后10周,小鼠的肝臟出現(xiàn)脂肪變性和纖維化。本研究表明，軟肝沖劑低劑量組和高劑量組均能顯著降低血液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C、ALT和AST的含量，降低肝臟組織中MDA水平，減輕過氧化反應，提高肝臟組織中SOD水平，使細胞中有足夠的SOD對抗過氧化反應，清除氧自由基，保護細胞膜免受自由基的攻擊。軟肝沖劑低劑量組的作用效果與護肝片相似，但軟肝沖劑高劑量組的效果則明顯優(yōu)于低劑量組和護肝片組，病理學HE和MASSON染色結果也充分證實了此結果。因此，軟肝沖劑可以改善肝臟功能，此結果保護肝細胞和抑制肝纖維化。

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收稿日期：2015-12-27

基金項目：遼寧省自然科學基金(201101142)；遼寧省社會發(fā)展攻關計劃(2012225018)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201607006

Pathological changes in liver fibrosis model of mice and therapeutic effects of Ruangan granule

LIU You1,ZHANG Xiao-huan1,BAI Jian2,3*,ZHANG Li-ping2,WANG Xue-liang2

(1.General Hospital of PLA Hainan Branch,Sanya 572000,China;2.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,China;3.Institute of Organ Transplantation,the 309th Hospital of Chinese PLA,Beijng 100091,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the pathological changes of liver fibrosis model in mice and the therapeutic effect of Ruangan granule (RGG) on liver fibrosis model in mice.MethodsTotally 60 male SPF class C57B/L mice were randomly divided into five groups,including control group,model group,colchicines group,RGG low group and RGG high group,12 mice in each group.Mice in control group were injected 100% peanut oil,1 mL/kg,twice a week in totally 10 weeks;mice in model group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week in 10 weeks;mice in liver-aid tablets group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week in 10 weeks,and colchicines was used from the third week until the tenth week,0.1 mg/(kg·d);mice in RGG low group were injected peanut oil containing 20% carbon tetrachloride,1 mL/kg,twice a week for 10 weeks,and RGG was used from the third week until the tenth week,1 g/(kg·d);mice in RGG high group were treated in the same way as RGG low group,but RGG was fed in 5 g/(kg·d).At the tenth week,blood samples were collected from the mice by removing eyes and the content of hyaluronic acid (HA),layer adhesion protein collagen type(LN),three former Ⅲ (PCⅢ),collagen-Ⅳ(Ⅳ-C),alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum were tested.The content of super oxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in liver tissue was tested;liver index was calculated;pathological and histological changes of mice liver were observed by HE and MASSON staining.ResultsThe levels of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C,ALT and AST in serum of mice in model group were significantly increased (P<0.05) compared with those in control group;the content of SOD in liver tissue was significantly lower (P<0.05);the content of MDA in liver tissue was significantly higher (P<0.05);liver index was significantly higher (P<0.05);HE pathological examination showed that there was necrosis of liver cells,fat vacuoles,fibrous tissue hyperplasia and inflammatory cell infiltration;MASSON pathological examination showed that there was necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.The levels of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C,ALT and AST in serum of mice in RGG groups were significantly reduced (P<0.05) compared with those in model group;SOD in liver tissue was significantly higher (P<0.05);MDA in liver tissue was significantly lower (P<0.05);liver index significantly decreased (P<0.05);pathological examination showed that there was no inflammatory infiltrates in liver tissue of fat vacuoles or fibrous tissue deposition;MASSON pathological examination showed that there was no necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.ConclusionIntraperitoneal injection of CCl4can form cirrhosis model of mice and pathological changes are mainly necrosis of liver cells,fat vacuoles and fibrous tissue hyperplasia.RGG can improve the function of liver and reduce the liver fibrosis of mice.

Key words：Ruangan granule;Liver fibrosis;SOD;MDA