陳　瑛，敖啟林，黃　磊，寧　楊，李　莉，王玉蘭，李　瑞，田　訓(xùn)，李賀梅，張慶華△

(1.華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014；2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科，武漢 430000)

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HIF-1α和Rac1在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義*

陳瑛1，敖啟林2，黃磊1，寧楊1，李莉1，王玉蘭1，李瑞1，田訓(xùn)1，李賀梅1，張慶華1△

(1.華中科技大學(xué)附屬武漢中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，武漢 430014；2.華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科，武漢 430000)

目的探討缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)和Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1(Rac1)在宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)和鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)以及臨床意義。方法采用免疫組織化學(xué)法檢測正常宮頸組織20例、宮頸CIN 42例(CINⅠ級12例，CINⅡ～Ⅲ級30例)、宮頸鱗狀細(xì)胞癌58例(高分化15例，中分化24例，低分化19例)中HIF-1α和Rac1蛋白的表達(dá)情況，以分析其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，并結(jié)合臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果HIF-1α蛋白在正常宮頸黏膜組織中的陽性表達(dá)率為0%(0/20)，CINⅠ級組織陽性表達(dá)率為16.7%(2/12)，CINⅡ～Ⅲ級組織陽性表達(dá)率為56.7%(17/30)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)率為81.0%(47/58)，其中高分化陽性表達(dá)率53.3%，中分化陽性表達(dá)率83.3%，低分化陽性表達(dá)率100%。HIF-1α蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中HIF-1α蛋白表達(dá)與其組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。Rac1蛋白表達(dá)在正常宮頸黏膜組織中的陽性表達(dá)率為0%(0/20)，宮頸CINⅠ級組織陽性表達(dá)率為8.3%(1/12)，宮頸CINⅡ～Ⅲ級組織陽性表達(dá)率為53.3%(16/30)，宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織陽性表達(dá)率為77.6%(45/58)，其中高分化陽性表達(dá)率60.0%，中分化陽性表達(dá)率73.0%，低分化陽性表達(dá)率94.7%。Rac1蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)依次升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織Rac1蛋白表達(dá)與其組織學(xué)分級、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。HIF-1α蛋白的陽性表達(dá)率與Rac1蛋白的陽性表達(dá)率呈正相關(guān)(r=0.3，P<0.05)。結(jié)論HIF-1α及Rac1聯(lián)合檢測蛋白表達(dá)有助于判斷宮頸鱗狀上皮腫瘤的病變程度及預(yù)后。

宮頸鱗狀細(xì)胞癌；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；Ras相關(guān)C3肉毒桿菌毒素底物1

宮頸癌是全球女性最常見的婦科惡性實(shí)體腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康。我國每年新增宮頸癌病例約13.5萬，占全球發(fā)病數(shù)量的1/3。缺氧是惡性實(shí)體瘤的基本特征之一，在缺氧環(huán)境中處于核心地位的缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)是一種異源二聚體蛋白復(fù)合物，由α和β兩個(gè)蛋白亞基組成，HIF-1α在動(dòng)物及人體的多種腫瘤組織中呈過度表達(dá)，促進(jìn)血管形成，維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝,影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和凋亡[1]。Ras 相關(guān) C3 肉毒桿菌毒素底物 1(Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1)是小G蛋白Rho家族的重要成員，在腫瘤組織中激活狀態(tài)的Rac1通過參與細(xì)胞骨架重組、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程[2]，影響腫瘤細(xì)胞的極性、黏附、生長和運(yùn)動(dòng)能力，而且越來越多的證據(jù)顯示Rac1能被缺氧激活[3]，在誘導(dǎo)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4]。

本研究擬對HIF-1α、Rac1蛋白在各種程度宮頸鱗狀細(xì)胞病變中的表達(dá)及其相關(guān)性進(jìn)行研究，探索其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為探討新的宮頸癌診斷和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料收集武漢市中心醫(yī)院2009年7月至2011年6月手術(shù)切除的宮頸組織共120例，其中子宮良性病變患者手術(shù)切除后的正常宮頸組織20例、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)42例(CINⅠ級12例、CINⅡ和Ⅲ級30例)、宮頸鱗狀細(xì)胞癌58例，患者平均年齡49.2歲，58例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)前均未接受放療、化療。組織學(xué)分級根據(jù)世界衛(wèi)生組織2003年腫瘤細(xì)胞分化程度分類標(biāo)準(zhǔn)：低分化癌19例，中分化癌24例，高分化癌15例。TNM分期根據(jù)FIGO 2000年修訂的標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期22例，Ⅱ期24例，Ⅲ期8例，Ⅳ期4例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例。上述所有病例的診斷均經(jīng)1～2位有豐富臨床病理診斷經(jīng)驗(yàn)的高級職稱病理醫(yī)師證實(shí)。

1.2試劑鼠抗人HIF-1α單克隆抗體為Neomarker公司產(chǎn)品，鼠抗人Rac1 單克隆抗體為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品，SP免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒、二甲苯、乙醇、PBS緩沖液pH7.4，乙二胺四乙酸(EDTA)緩沖液pH9.0、過氧化氫、蘇木素、1%鹽酸酒精等。

1.3免疫組織化學(xué)檢測上述組織標(biāo)本均置于10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色。鼠抗人HIF-1α單克隆抗體工作濃度為1∶50，鼠抗人Rac1單克隆抗體工作濃度為1∶50，梯度乙醇(100%、95%、80%、70%)。

1.4免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷HIF-1α和Rac1的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):HIF-1α的陽性表達(dá)為細(xì)胞核或胞質(zhì)被染成淺黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。Rac1蛋白陽性表達(dá)主要位于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，呈淺黃色或深黃色。

按染色強(qiáng)度計(jì)分:無染色計(jì)0分,輕度染色計(jì)1分,中度染色計(jì)2分,強(qiáng)染色計(jì)3分;按陽性染色細(xì)胞百分率計(jì)分:陽性細(xì)胞數(shù)小于或等于10%計(jì)0分,陽性細(xì)胞數(shù)>10%～25%計(jì)1分,陽性細(xì)胞數(shù)>25%～50%計(jì)2分,陽性細(xì)胞數(shù)大于50%計(jì)3分。然后將兩類計(jì)分結(jié)果的乘積得分分為以下等級:0分為-,1～2分為+,3～4分為++,5～6分為+++。設(shè)定+～+++為陽性表達(dá),-為陰性表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)分析HIF-1α和Rac1在各宮頸組織中的表達(dá)，應(yīng)用Spearman等級相關(guān)性分析進(jìn)行HIF-1α和Rac1的相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織、宮頸CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)HIF-1α及Rac1其在各組宮頸病變中表達(dá)情況見表1和圖1。HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織中無表達(dá)，HIF-1α在CINⅠ級、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率(16.7%、56.7%、81.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2HIF-1α及Rac1與宮頸鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分級、分期及淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)系在不同臨床分期的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中,HIF-1α在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達(dá)率(78.3%vs. 91.7%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Rac1在Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期的陽性表達(dá)率(73.9%vs. 91.7%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，隨期別的進(jìn)展而升高(表2)。

圖1　　HIF-1α及Rac1在正常宮頸組織、CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(SP×100)

組別nHIF-1α陰性陽性陽性率(%)PRac1陰性陽性陽性率(%)P正常宮頸組織202000<0.052000<0.05CINⅠ1210216.71118.3CINⅡ～Ⅲ30131756.7141653.3宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織58114781.0134577.6

表2　　HIF-1α和Rac1蛋白表達(dá)與宮頸鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系

Rac1在CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ級、宮頸鱗狀細(xì)胞癌的陽性表達(dá)率(8.3%、53.3%、77.6%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在不同組織學(xué)分化程度的宮頸鱗狀細(xì)胞癌中,HIF-1α在低分化組、中分化組、高分化組的陽性表達(dá)率(100.0%、83.3%、53.3%)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)， Rac1在低分化組、中分化組、高分化組的陽性表達(dá)率(94.7%、75.0%、60.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。58例宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的HIF-1α及Rac1陽性表達(dá)率均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。

2.3在宮頸CIN組織和宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中HIF-1α和Rac1表達(dá)的相關(guān)性42例宮頸CIN組織中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表達(dá)陽性14例，共同表達(dá)陰性20例，采用Spearman等級相關(guān)性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.3,P<0.05)見表3。

表3　　宮頸CIN組織中HIF-1α和Rac1蛋白表達(dá)的關(guān)系(n)

58例宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中，Rac1和HIF-1α蛋白共同表達(dá)陽性40例，共同表達(dá)陰性6例，采用Spearman等級相關(guān)性分析，Rac1和HIF-1α蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.3，P<0.05)，見表4。

表4　　宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中HIF-1α和Rac1蛋白表達(dá)的關(guān)系(n)

3　討　　論

HIF-1α盡管在正常氧濃度下也表達(dá),但很快可被泛素蛋白酶體系統(tǒng)所降解;而在缺氧狀態(tài)時(shí)其降解過程被阻斷,導(dǎo)致HIF-1α在核內(nèi)蓄積,與β蛋白亞基結(jié)合，形成有活性的HIF-1,啟動(dòng)多種下游基因[5],使細(xì)胞適應(yīng)缺氧狀態(tài)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和分裂，而且可通過減少有氧代謝中反應(yīng)性氧類對細(xì)胞 DNA 復(fù)制的破壞，促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

大量免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)已證明，HIF-1α 在人類多種腫瘤中表達(dá)增加，HIF-1α通過調(diào)節(jié)不同靶基因的轉(zhuǎn)錄活性及其自身的表達(dá)，參與腫瘤的增殖凋亡與侵襲轉(zhuǎn)移等過程，其過度表達(dá)與惡性腫瘤的不良預(yù)后有關(guān)[6]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也顯示：HIF-1α蛋白在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于宮頸CIN組織及正常子宮頸組織，且宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織HIF-1α表達(dá)與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)，說明HIF-1α蛋白高表達(dá)的宮頸鱗狀細(xì)胞癌具有更強(qiáng)的侵襲能力，提示HIF-1α其過度表達(dá)可能與宮頸癌不良預(yù)后有關(guān)，對其表達(dá)程度的檢測具有重要的生物學(xué)和臨床價(jià)值。

Rac-1 基因位于人染色體7p22，有Rac1、Rac2、Rac3 3個(gè)亞型。Rac1蛋白可廣泛表達(dá)于機(jī)體各組織中，通過結(jié)合或水解GTP 核苷酸，在GDP 結(jié)合形式( 失活狀態(tài))與 GTP 結(jié)合形式( 激活狀態(tài)) 之間相互轉(zhuǎn)換[7]。腫瘤組織中活性形式的Rac1蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞絲狀偽足的生成以及膜皺縮[7-9],調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，影響腫瘤的生長。此外，Rac1還通過增加細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子，抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[10]，對腫瘤的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移起著重要的作用。

目前大多數(shù)試驗(yàn)表明Rac1與人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系，在多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)，Rac1在腫瘤及其增殖、轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[11]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中Rac1的表達(dá)高于宮頸CIN組織，且與浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)。宮頸CIN組織中高級別病變的Rac1表達(dá)高于低級別病變，高于正常宮頸組織。

近年來有研究發(fā)現(xiàn)在某些惡性腫瘤中存在HIF-1α和Rac1蛋白共同表達(dá)的情況， Rac1通過抑制VHL蛋白水平可在低氧環(huán)境中增加HIF-1α的穩(wěn)定性,進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤血管的生成[12]。此外Rac1是HIF-1α的上游調(diào)控基因，Rac1可通過結(jié)合蛋白激酶調(diào)節(jié)缺氧引起的HIF-1及HIF-1 相關(guān)蛋白的磷酸化和氧化還原反應(yīng)，從而參與HIF-1α的活化，促進(jìn)其表達(dá)[13]。Rac1通過激活p38MAPK 活化HIF-1α末端活性區(qū)(TAD),從而提高了HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。DU等[14]研究發(fā)現(xiàn)Rac1在人類乳腺癌中能激活促進(jìn)HIF-1α的表達(dá)。本研究分析顯示， HIF-1α與Rac1的表達(dá)在宮頸癌前病變及宮頸鱗狀細(xì)胞癌中呈正相關(guān)(r=0.3,P<0.05),且隨宮頸病變的進(jìn)展而變化的趨勢也基本一致，提示HIF-1α與Rac1可能有著較密切的聯(lián)系。

綜上所述,HIF-1α和Rac1在宮頸癌前病變及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平均明顯增高，浸潤深度越深，分化程度越低，表達(dá)水平越高。且在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中二者的表達(dá)呈正相關(guān)，提示在宮頸鱗狀細(xì)胞癌的病理演變過程中，HIF-1α與Rac1相互間可能存在協(xié)同調(diào)控作用，促進(jìn)了宮頸癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移。分析二者協(xié)同作用的機(jī)制可能為腫瘤組織中Rac1通過激活p38MAPK活化HIF-1α末端活性區(qū)(TAD)，提高了HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[4]，且通過抑制VHL蛋白水平在低氧狀態(tài)下增加了HIF-1α的穩(wěn)定性[15]。

總之，HIF-1α及Rac1的聯(lián)合檢測有助于判斷宮頸上皮內(nèi)瘤變的病變程度，評價(jià)宮頸鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為和預(yù)后，為其早期診斷和治療提供理論依據(jù)。

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武漢市衛(wèi)生局臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目資助(WX11B05)。作者簡介：陳瑛(1979-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。△

，E-mail:zhangqh66@qq.com。

R711.74

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1671-8348(2016)20-2828-04

2016-02-11

2016-04-18)

·經(jīng)驗(yàn)交流·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.030