馬敏先，何志旭，王　梅，葉　川,王　永，曾　筱，張俊標(biāo)，劉　琴

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程中心，貴陽 550004;3.貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科　550002；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴陽 550004)

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PHBHHx與人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的體內(nèi)異位成骨研究*

馬敏先1，何志旭2，王梅3，葉川4,王永1，曾筱1，張俊標(biāo)1，劉琴1

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔修復(fù)科，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與組織工程中心，貴陽 550004;3.貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔修復(fù)科550002；4.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴陽 550004)

目的探討以3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(PHBHHx)為支架材料，以人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCMSCs)為種子細(xì)胞的復(fù)合物體內(nèi)構(gòu)建組織工程骨的能力。方法將hUCMSCs接種在PHBHHx上體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2周，誘導(dǎo)組為實(shí)驗(yàn)組，不滴加hUCMSCs組為對(duì)照組，植入裸鼠皮下，并分別于1、3、5個(gè)月取材行HE、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)、堿性磷酸酶染色及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)。結(jié)果PHBHHx表現(xiàn)出良好的細(xì)胞吸附性。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞大、小形態(tài)基本保持原狀，成骨特異性指標(biāo)檢測(cè)均為陽性；對(duì)照組細(xì)胞則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解，成骨特異性指標(biāo)均為陰性。結(jié)論P(yáng)HBHHx復(fù)合hUCMSCs經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)后具有在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程骨的能力。

間充質(zhì)干細(xì)胞；組織工程；骨；3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯

近年來，種植義齒已成為牙列缺損或缺失患者主流的修復(fù)方法。目前采用的引導(dǎo)骨再生技術(shù)、上頜竇提升術(shù)等只能修復(fù)少量的牙槽骨缺損；自體骨移植雖然安全可靠，無免疫排斥，但將造成供區(qū)繼發(fā)損傷和并發(fā)癥；異體或異種骨移植能修復(fù)較大骨缺損，但存在免疫排斥。如今骨組織工程已被認(rèn)為是修復(fù)大段骨缺損最有希望的方法之一[1]，支架材料與種子細(xì)胞是其中最重要的兩個(gè)因素。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)含量豐富，具有低免疫原性，取材及分離培養(yǎng)過程對(duì)供者無損害，不涉及社會(huì)倫理等方面的爭議，在組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[2-3]。3-羥基丁酸-3-羥基己酸共聚酯(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate,PHBHHx)因具有較佳的力學(xué)性能、良好的生物相容性和可完全降解性，在組織工程和醫(yī)用材料領(lǐng)域備受關(guān)注[4-6]。目前，PHBHHx在組織工程軟骨、血管、心臟瓣膜等領(lǐng)域研究較多[7]，但在骨組織工程研究領(lǐng)域中國內(nèi)、外報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)以hUCMSCs為種子細(xì)胞，以PHBHHx為支架材料，對(duì)hUCMSCs和PHBHHx作為骨組織工程種子細(xì)胞和可吸收載體材料應(yīng)用的可行性進(jìn)行研究。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物裸鼠購自北京華阜康生物科技股份有限公司，SPF級(jí)，4～5周齡，16～18 g，許可證號(hào)：SCXK(京)2009-0007。

1.2儀器與試劑Thermo 3131型CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司，中國)，Nikon TE-2000型倒置相差顯微鏡(Nikon公司，日本)，2331型PCR擴(kuò)增儀(Eppendorf公司，德國)，BYY-BC型電泳儀(北京六一儀器廠)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司 ，美國)，胎牛血清(杭州四季青)，堿性磷酸酶染色試劑盒(南京建成生物有限公司)，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色試劑盒(武漢博士德生物有限公司)。

1.3臍帶及支架材料來源臍帶從貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院產(chǎn)科獲得，均來自足月妊娠剖宮產(chǎn)健康胎兒。經(jīng)產(chǎn)婦及家屬同意，臍帶標(biāo)本用于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。PHBHHx由清華大學(xué)化工系研制并提供，孔徑為100～200 μm，孔隙率90%，孔間相互連通。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1hUCMSCs體外分離培養(yǎng)及鑒定無菌收集臍帶，剝離華通膠，將其剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，均勻接種于含完全培養(yǎng)基(低糖DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清)的培養(yǎng)瓶內(nèi)，置37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長和形態(tài)變化；當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)90%時(shí)，按1∶2的比例傳代。

1.4.2hUCMSCs向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定收集第4代hUCMSCs，將細(xì)胞以1×105/mL的密度接種于6孔板，用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，次日實(shí)驗(yàn)組更換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1×10-8mol/L地塞米松、50 mg/L維生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基)進(jìn)行成骨細(xì)胞誘導(dǎo)，對(duì)照組用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)液，誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)和堿性磷酸酶染色(alkaline phosphatase,ALP)染色，21 d后進(jìn)行茜素紅染色。

1.4.3hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物的構(gòu)建并植入裸鼠皮下將PHBHHx切成1.00 cm×0.50 cm×0.05 cm大小，高溫高壓消毒，利用完全培養(yǎng)基浸泡備用。收集第4代hUCMSCs，按 2×107/mL的密度將細(xì)胞懸液滴加在PHBHHx上，2 d后更換培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組更換為成骨誘導(dǎo)液,對(duì)照組則是未滴加細(xì)胞成分的PHBHHx。 hUCMSCs/PHBHHx體外復(fù)合培養(yǎng)2周，用10%水合氯醛作裸鼠腹腔注射麻醉(5 mL/kg)，消毒皮膚，在背部正中切開長約1 cm，血管鉗鈍性分離后左側(cè)和右側(cè)皮下分別植入實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞/材料復(fù)合物，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各植入12塊復(fù)合物。術(shù)后裸鼠單只分籠飼養(yǎng)，觀察裸鼠整體和切口愈合情況及復(fù)合物形態(tài)變化。

1.4.4檢測(cè)指標(biāo)于植入后第1、3、5個(gè)月分別予戊巴比妥安樂死處理4只裸鼠，石蠟包埋，組織切片行HE、Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)、ALP染色。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)第3、5個(gè)月實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的骨特異性Ⅰ型膠原和骨橋蛋白mRNA的表達(dá)情況。引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小及引物序列分別如下：β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為564 bp，上游引物5′-CTG GGA CGA CAT AGG AGA AAA-3′，下游引物5′-AAG GAA GGC TGG AAG AGT GC-3′；Ⅰ型膠原蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物大小為371 bp，上游引物5′-GGC AAG GTG TTG TGC GAT GAC-3′，下游引物5′-AGA CCA CGA GGA CCA GAG GGA C-3′；骨橋蛋白擴(kuò)增產(chǎn)物大小為280 bp，上游引物5′- TGC TGG TGT AGA CCC CAA AAG-3′，下游引物5′- CAG GGA GTT TCC ATG AAG CCA C-3′。

2　結(jié)　　果

2.1hUCMSCs形態(tài)學(xué)觀察及鑒定原代培養(yǎng)6 d左右組織塊周圍有細(xì)胞爬出，貼壁生長，12 d左右細(xì)胞生長增快、數(shù)量增多，呈平行排列或漩渦狀生長，傳至第4代以后，細(xì)胞形態(tài)較單一，多為長梭形。

A：成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色(×100)；B：成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色(×100)；C：成骨細(xì)胞茜素紅染色(×100)。

圖1hUCMSCs成骨分化及鑒定

A～C：hUCMSCs/PHBHHx植入裸鼠背部皮下1(A)、3(B)、5(C)個(gè)月大體觀；D～F：hUCMSCs/PHBHHx實(shí)驗(yàn)組植入1(D)、3(E)、5(F)個(gè)月大體觀；G～H：hUCMSCs/PHBHHx對(duì)照組植入1(G)、3(H)個(gè)月大體觀。

圖2hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物植入裸鼠大體觀

A～C：hUCMSCs/PHBHHx實(shí)驗(yàn)組植入1(A)、3(B)個(gè)月HE染色(×100),5(C)個(gè)月HE染色(×300)；D～E：PHBHHx對(duì)照組植入1(D)、3(E)個(gè)月HE染色(×100)。

圖3hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物HE染色

A:1個(gè)月；B：3個(gè)月；C：5個(gè)月。

圖4hUCMSCs/PHBHHx實(shí)驗(yàn)組植入1、3、5個(gè)月Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色(×100)

2.2hUCMSCs成骨分化及鑒定成骨誘導(dǎo)14 d，Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色呈陽性，細(xì)胞膜及細(xì)胞外基質(zhì)呈棕黃色，提示局部有Ⅰ型膠原合成和分泌(圖1A)，對(duì)照組染色呈陰性；堿性磷酸酶染色呈陽性，胞質(zhì)中呈現(xiàn)灰黑色顆?；驐l狀、塊狀沉淀(圖1B)，對(duì)照組染色呈陰性；成骨誘導(dǎo)21 d，茜素紅染色呈陽性，細(xì)胞匯合聚集后呈多層重疊生長，圓形的礦化結(jié)節(jié)呈紅色，周圍折光性增強(qiáng)(圖1C)，對(duì)照組細(xì)胞無礦化結(jié)節(jié)形成，染色呈陰性。

2.3hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物植入裸鼠大體觀實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞/支架復(fù)合物的大小形態(tài)于1、3、5個(gè)月基本保持原狀，質(zhì)地變硬；而對(duì)照組細(xì)胞/支架復(fù)合物則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解(圖2A、2B、2C)。 實(shí)驗(yàn)組1個(gè)月時(shí)取材見大部分區(qū)域仍呈灰白色，表面形成纖維包裹，略光滑，質(zhì)韌；3個(gè)月時(shí)表面微紅，質(zhì)地稍硬，仍有少量材料殘留；5個(gè)月時(shí)復(fù)合物被硬組織替換，色紅，厚度增加，硬度增大，新生血管相互融合(圖2D、2E、2F)。對(duì)照組1個(gè)月時(shí)取材見植入物體積縮小，表面呈灰白色，未見纖維包裹；3個(gè)月時(shí)體積明顯縮小，大多降解，僅殘留少許碎塊，色澤略深；5個(gè)月時(shí)完全降解，僅見少許黏液樣物質(zhì)(圖2G、2H)。

2.4HE染色實(shí)驗(yàn)組1個(gè)月時(shí)細(xì)胞沿PHBHHx孔壁生長，骨組織雛形形成，骨小梁、骨髓腔組織結(jié)構(gòu)清楚，骨小梁周邊成骨細(xì)胞被覆并產(chǎn)生骨基質(zhì)，骨基質(zhì)內(nèi)見骨細(xì)胞及小血管增生，部分材料降解；3個(gè)月時(shí)較多編織骨組織和少量板層骨組織形成，組織結(jié)構(gòu)清楚，板層骨內(nèi)見哈佛斯系統(tǒng)雛形，仍有少量材料殘留；5個(gè)月時(shí)較多板層骨組織形成，結(jié)構(gòu)清楚，板層骨內(nèi)見較多哈弗斯系統(tǒng)樣結(jié)構(gòu)形成，大量骨小梁形成，其內(nèi)見較多骨細(xì)胞，表面被覆生長活躍的成骨細(xì)胞，材料完全降解(圖3A、3B、3C)。對(duì)照組1個(gè)月時(shí)PHBHHx表面有大量的空泡和較多的炎性細(xì)胞，見明顯PHBHHx殘留；3個(gè)月時(shí)PHBHHx表面有少量的空泡和炎性細(xì)胞，無明顯PHBHHx殘留(圖3D、3E)。

2.5Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)組1個(gè)月時(shí)呈微弱陽性(圖4A)，3個(gè)月時(shí)呈陽性(圖4B)，5個(gè)月時(shí)呈強(qiáng)陽性，細(xì)胞外基質(zhì)有大量的棕黃色異染區(qū)(圖4C)；對(duì)照組染色陰性。

2.6堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)組1個(gè)月時(shí)呈微弱陽性(圖5A)，3個(gè)月時(shí)呈陽性(圖5B)，5個(gè)月時(shí)呈強(qiáng)陽性，呈藍(lán)紫色表達(dá)(圖5C)；對(duì)照組染色陰性。

2.7RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)月時(shí)Ⅰ型膠原蛋白mRNA在371 bp條帶表達(dá)，骨橋蛋白mRNA呈陰性表達(dá)；對(duì)照組均呈陰性表達(dá)(圖6A、6B)。5個(gè)月時(shí)Ⅰ型膠原蛋白mRNA在371 bp條帶表達(dá)，骨橋蛋白mRNA在280 bp條帶表達(dá)；對(duì)照組均呈陰性表達(dá)(圖6C、6D)。

A:1個(gè)月；B：3個(gè)月；C：5個(gè)月。

圖5hUCMSCs/PHBHHx實(shí)驗(yàn)組植入1、3、5個(gè)月堿性磷酸酶染色(×100)

A～B：hUCMSCs/PHBHHx植入3個(gè)月Ⅰ型膠原、骨橋蛋白的基因表達(dá)；C、D：hUCMSCs/PHBHHx植入5個(gè)月Ⅰ型膠原、骨橋蛋白的基因表達(dá)；1：實(shí)驗(yàn)組；2：對(duì)照組。

圖6hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物的基因表達(dá)

3　討　　論

種子細(xì)胞的獲取是骨組織工程研究的基礎(chǔ)。體外分離擴(kuò)增hUCMSCs的方法目前主要有酶消化法和組織塊貼壁法。前者具有快速分離MSCs的優(yōu)勢(shì)，但酶體系有可能降解細(xì)胞外膜，甚至對(duì)細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞貼壁。本實(shí)驗(yàn)選用組織塊貼壁法對(duì)華通膠來源的hUCMSCs進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，研究結(jié)果與徐燕等[8]的一致，該方法能更加簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷地分離出具有高增殖活性及多向分化潛能的MSCs。

可吸收支架材料是骨組織工程的核心要素之一。材料的物理性質(zhì)會(huì)對(duì)細(xì)胞的黏附等產(chǎn)生很大的影響，親水性的表面有利于細(xì)胞的黏附和生長，多孔結(jié)構(gòu)用于營養(yǎng)物質(zhì)的滲透和細(xì)胞的正常代謝。一般通過表面改性的方法加以改進(jìn)，如通過培養(yǎng)基浸泡離子注入，多聚賴氨酸包埋等對(duì)材料表面進(jìn)行修飾以改善其親水性和細(xì)胞吸附性[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過用完全培養(yǎng)基浸泡支架材料的方法，提高材料的親水性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：材料上的細(xì)胞數(shù)量增多，呈梭形或多角形，表面光滑，增殖較快。說明用完全培養(yǎng)基浸泡后的材料更能模擬細(xì)胞的體外生長環(huán)境，有利于細(xì)胞的黏附和增殖。

hUCMSCs/PHBHHx復(fù)合物植入裸鼠背部皮下，誘導(dǎo)組細(xì)胞/支架復(fù)合物的大小形態(tài)于第1、3、5個(gè)月基本保持原狀，但質(zhì)地變硬。HE染色誘導(dǎo)組1個(gè)月時(shí)見骨組織雛形，3個(gè)月時(shí)見較多編織骨組織及哈弗斯系統(tǒng)雛形，5個(gè)月時(shí)見較多板層骨組織及哈弗斯系統(tǒng)樣結(jié)構(gòu)，這說明植入物在體內(nèi)經(jīng)歷5個(gè)月的成熟并逐漸成骨。Ⅰ型膠原免疫組織化學(xué)及ALP染色由弱陽性-陽性-強(qiáng)陽性的過程正好印證了植入物在體內(nèi)的成骨情況。以上均表明誘導(dǎo)組在脫離體外誘導(dǎo)環(huán)境后hUCMSCs并未失去成骨細(xì)胞表型同時(shí)能繼續(xù)增殖及分泌細(xì)胞外基質(zhì)，可以代償PHBHHx的降解而維持整個(gè)復(fù)合物的原有形態(tài)。對(duì)照組PHBHHx則不能保持原狀，體積逐漸縮小至完全降解。HE染色1個(gè)月時(shí)PHBHHx表面有較多的炎性細(xì)胞，見明顯材料殘留；3個(gè)月時(shí)PHBHHx表面有少量的炎性細(xì)胞，無明顯材料殘留。相關(guān)特異性指標(biāo)均為陰性。提示PHBHHx作為支架材料在體內(nèi)有良好的生物相容性和合適的降解率。

RT-PCR檢測(cè)又從基因?qū)用骝?yàn)證了以上結(jié)果，其中Ⅰ型膠原蛋白在第3、5個(gè)月時(shí)基因表達(dá)均呈陽性，而OPN基因表達(dá)在第3個(gè)月時(shí)呈陰性，第5個(gè)月時(shí)呈弱陽性?？赡芤?yàn)镺PN是成骨分化中晚期的標(biāo)志，細(xì)胞/支架復(fù)合物經(jīng)體外誘導(dǎo)植入體內(nèi)成骨需要一定的時(shí)間積累，要形成成熟的骨組織，還需要體內(nèi)相關(guān)環(huán)境因素的作用[11-14]，如生理刺激等[15]。

本實(shí)驗(yàn)基于骨組織工程的基本原理，結(jié)果提示PHBHHx復(fù)合hUCMSCs經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)后具有在裸鼠體內(nèi)異位構(gòu)建組織工程骨的能力，為初步構(gòu)建組織工程骨提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但細(xì)胞上架率低、分布不均勻、PHBHHx仍存在親水性等方面的不足需要在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步改進(jìn)。

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Heterotopic osteogenesis in vivo of PHBHHx and human umbilical cord mesenchymal stem cells*

MaMinxian1，HeZhixu2，WangMei3，YeChuan4,WangYong1，ZengXiao1，ZhangJunbiao1，LiuQin1

(1.DepartmentofProsthodontics,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 2.CenterofStemCellsandTissueEngineering,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 3.DepartmentofProsthodontics,GuiyangMunicipalStomatologicalHospital,Guiyang,Guizhou550002,China; 4.DepartmentofOrthopedic,AffiliatedHospitalofGuizhouMedicialUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China)

ObjectiveTo explore the ability for constructing tissue engineering bone in vivo in complex scaffolds with PHBHHx as the scaffolds material and human umbilical cord mensenchymal stem cells (hUCMCs) as the seed cells.MethodshUCMSCs were inoculated into PHBHHx scaffolds to induce osteogenesis culture in vivo for two weeks,the the induced group was the experimental group and those without instilling hUCMCs served as the control group,the nude mouse subcutaneous implantation was performed.Then taking material at 1,3,5 months after implantation in vivo was performed for conducting HE,collagenⅠimmunohistochemical,alkaline phosphatase staining and RT-PCR.ResultshUCMSCs showed good cellular adsorbability.The size and form in the experimental group basically maintained the original status,and the osteogenesis specific indicators were positive;but the control group did not keek the original status,its volume was gradually shrunk until complete degradation,and the osteogenesis specific indicators were negative.ConclusionThe PHBHHx scaffolds combined with hUCMSCs has the capability of in vivo heterotopic constructing tissue engineering bone in nude mouse by in vitro osteogenic induction.

mesenchymal stem cells;tissue engineering;bone;PHBHHx

貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目[黔科合J字(2010)2177號(hào)]；貴州省科學(xué)技術(shù)聯(lián)合基金資助項(xiàng)目[黔科合LG字(2012)002號(hào)]。作者簡介：馬敏先(1971-)，副主任醫(yī)師，碩士，主要從事種植及骨組織工程方面的研究。

R68

A

1671-8348(2016)20-2740-04

2015-12-08

2016-02-26)

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.002