李健春，王　麗，姜　寧，王　瓊△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000；2.中西醫(yī)結(jié)合防治器官纖維化實驗室/中西醫(yī)結(jié)合研究中心/西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000)

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腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子原核表達載體的構(gòu)建及其生物學(xué)活性分析*

李健春1,2，王麗2，姜寧1，王瓊1△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州 646000；2.中西醫(yī)結(jié)合防治器官纖維化實驗室/中西醫(yī)結(jié)合研究中心/西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院，四川瀘州 646000)

目的構(gòu)建含有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的原核表達質(zhì)粒pET28a(+)/BDNF及相應(yīng)的原核表達菌，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達后研究其生物學(xué)活性。方法按照大腸桿菌BL21(DE3)的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，人工合成大鼠BDNF的基因序列并構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a(+)/BDNF。經(jīng)限制性內(nèi)切酶(Bam HI,Hind Ⅲ)酶切鑒定及DNA測序鑒定后導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，用SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達情況，以BDNF特異性抗體采用Western blot法鑒定BDNF蛋白抗原性，四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測BDNF蛋白對PC12細胞活力的影響。結(jié)果構(gòu)建的pET28a(+)/BDNF經(jīng)雙酶切和測序鑒定與設(shè)計序列100%一致；工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量17×103左右有1條明顯蛋白條帶，Western blot顯示目的蛋白能夠與特異性BDNF抗體反應(yīng)；不同濃度BDNF蛋白處理組與對照組比較細胞活力均有不同程度的增加，其中50 ng/mL BDNF處理組效果最優(yōu)。結(jié)論成功構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28a(+)/BDNF及相應(yīng)的原核表達菌，該工程菌表達的BDNF蛋白具有良好的生物學(xué)活性。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；原核表達；生物學(xué)活性

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)最初是由Brade從豬腦中分離、純化的一種堿性蛋白質(zhì)[1]。BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的一員，其主要功能是調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性，生長、生存及長期記憶[2]。此外，BDNF與神經(jīng)退行性疾病發(fā)生高度相關(guān)，在治療阿爾茨海默病[3]、精神分裂癥[4]、抑郁癥[5]、多發(fā)性硬化癥[6]等中樞神經(jīng)疾病中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，組織中BDNF含量極低，從3 kg腦組織中僅能提取2 μg BDNF蛋白[1]，對其臨床運用和分析鑒定都帶來較大的挑戰(zhàn)。近年來神經(jīng)生長因子家族一些成員被用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治，然而，BDNF用于此類系統(tǒng)疾病的防治卻罕見報道。本實驗旨在通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法建立一種制備BDNF操作簡單、穩(wěn)定性高的方法，為下一步BDNF在中樞神經(jīng)疾病的治療中的應(yīng)用和功能研究奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料大腸桿菌BL21(DE3)購于北京全式金公司；原核表達載體pET28a(+)、PC12細胞為本實驗室保存。

1.2儀器與試劑HiTrap SP Sepharose FF層析柱購自GE公司；HRP標記羊抗兔多克隆抗體購自中杉金橋生物公司；兔抗BDNF多克隆抗體購自Santa Cruz公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；DMEM細胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；質(zhì)粒抽提試劑盒購自O(shè)mega公司；高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自康為世紀(北京)公司；Bam HI、Hind Ⅲ酶購自Takara公司；其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純；蛋白電泳儀、多功能酶標儀購自BIO-RAD公司。

1.3方法

1.3.1重組BDNF序列設(shè)計與合成根據(jù)GenBank公布的大鼠BDNF 氨基酸序列(登錄號NP_001257559.1)，利用在線密碼子優(yōu)化工具JCAT優(yōu)化密碼子，優(yōu)化后序列5′端引入Bam HI酶切位點，3′端引入Hind Ⅲ酶切位點，全長序列由金唯智生物科技(蘇州)有限公司合成。

1.3.2BDNF工程菌的構(gòu)建與鑒定將合成的基因序列通過Bam HI、Hind Ⅲ酶切位點亞克隆至pET28a(+)載體中，熱激法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，轉(zhuǎn)化后涂布于LB固體培養(yǎng)基(卡那霉素，50 μg/mL)中，倒置培養(yǎng)12 h，挑取陽性克隆，按說明書方法抽提質(zhì)粒進行酶切鑒定。酶切鑒定正確后送金唯智生物科技(蘇州)有限公司測序。

1.3.3BDNF工程菌誘導(dǎo)表達與BDNF蛋白可溶性分析將經(jīng)酶切和測序鑒定正確的陽性克隆接種于5 mL LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)過夜。次日，以1%比例(v/v)接種到相同抗生素終濃度的LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，加入異丙基硫代半乳糖苷至終濃度為0.5 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 ℃、 8 000 r/min離心5 min，棄上清液收集沉淀，沉淀經(jīng)PBS洗滌后，以5 g/mL比例充分重懸于裂解液(20 mmol/L Tris·Hcl,2 mmol/L乙二胺四乙酸,pH=8.0)，置冰上超聲破碎(250 W，超2 s，停4 s；作用30 min)，革蘭染色檢測破碎程度，4 ℃、 12 000 r/min離心20 min收集沉淀和上清液，沉淀用緩沖液[20 mmol/L羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES),8 mol/L尿素,pH=8.0]溶解，SDS-PAGE電泳檢測上清液和沉淀中BDNF的含量。

1.3.4重組BDNF蛋白的純化利用BDNF高等電點特性(pI=9.99)，在HEPES緩沖液中帶正電荷，選擇陽離子交換層析進行純化。將步驟1.3.3的沉淀樣品依次用含2.0 mol/L尿素、4.0 mol/L尿素的PBS(pH=7.5)緩沖液洗滌。4 ℃、 15 000 r/min離心30 min收集沉淀，沉淀溶解于緩沖液(20 mmol/L HEPES,8 mol/L尿素,pH=8.0)，4 ℃攪拌過夜。次日，4 ℃、 15 000 r/min離心30 min收集上清液，0.22 μm濾膜過濾后進行純化。純化條件為：采用1 mL HiTrap SP Sepharose FF層析柱，流速0.75 mL/min；上樣完成后，先使用緩沖液(20 mmol/L HEPES,8.0 mol/L尿素,pH=8.0)平衡至基線后，再用緩沖液(20 mmol/L HEPES,8.0 mol/L尿素,0.5 mol/L Nacl,pH=8.0)線性洗脫。收集洗脫液，采用BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳檢測純化后樣品純度。

1.3.5Western blot鑒定BDNF蛋白抗原性取純化后BDNF蛋白進行SDS-PAGE電泳，用濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(轉(zhuǎn)膜條件：200 mA,50 min)轉(zhuǎn)移至PVDF膜進行Western blot分析：5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入兔抗鼠BDNF多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜；TBST洗滌5次(每次5 min)后用HRP標記羊抗兔IgG(1∶10 000稀釋)室溫孵育1 h；TBST洗滌5次(每次5 min)后ECL系統(tǒng)顯影，拍照，記錄結(jié)果。

1.3.6四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測BDNF蛋白對PC12細胞活力的影響取對數(shù)生長期PC12細胞，以1.0×104/孔接種于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h；吸出培養(yǎng)基，加入終濃度為20～400 ng/mL的BDNF蛋白，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔；培養(yǎng)24 h后，MTT法檢測細胞活力，利用酶標儀在490 nm處測定各組細胞吸光度(A)值。細胞存活率=A處理組/A對照組×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1重組BDNF基因序列密碼子優(yōu)化大鼠成熟BDNF基因序列全長357 bp，利用在線密碼子優(yōu)化工具JCAT優(yōu)化后密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)為96.00%，GC含量為50.14%。

2.2BDNF工程菌的構(gòu)建與鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)Bam HI、Hind Ⅲ雙酶切后，瓊脂糖電泳顯示在約360 bp處出現(xiàn)1條條帶，與目的基因片段大小相符(圖1)。DNA測序結(jié)果顯示與目的序列100%一致，重組質(zhì)粒pET28a(+)/BDNF構(gòu)建正確。

1:DNA Ladder;2:重組pET28a(+)/BDNF質(zhì)粒經(jīng)Bam HI單酶切;3:pET28a(+)/BDNF質(zhì)粒經(jīng)Bam HI和Hind Ⅲ雙酶切;4:pET28a(+)質(zhì)粒經(jīng)Bam HI單酶切。

圖1重組質(zhì)粒pET28a(+)/BDNF酶切鑒定

2.3BDNF工程菌誘導(dǎo)表達與BDNF蛋白可溶性分析工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE電泳在相對分子質(zhì)量17×103左右有1條明顯特異性蛋白條帶，與理論預(yù)測值相符，見圖2。表明該工程菌可表達BDNF蛋白，其表達量占菌體總蛋白的15%。培養(yǎng)基上清液(圖片中未列出)和誘導(dǎo)后的細菌裂解液在上清液中均未出現(xiàn)目的蛋白，而在沉淀中具有明顯蛋白條帶，故認為BDNF蛋白主要以包涵體形式存在。

2.4重組BDNF蛋白的純化重組BDNF蛋白經(jīng)陽離子層析純化后，樣品純度為85.6%，見圖3。

2.5BDNF蛋白抗原性分析用兔抗鼠BDNF抗體作用后出現(xiàn)陽性條帶，說明該工程菌表達的BDNF蛋白能與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，具有良好的抗原性。

2.6MTT法檢測BDNF蛋白對PC12細胞活力的影響結(jié)果顯示BDNF蛋白處理組與對照組比較均有不同程度的增加；20、50、100、400 ng/mL處理組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中，50 ng/mL處理組效果最優(yōu)，見圖4。

1:蛋白Marker;2：工程菌誘導(dǎo)后超破裂解上清液；3：工程菌誘導(dǎo)后總蛋白;4:工程菌誘導(dǎo)后超破裂解沉淀。

圖2重組BDNF蛋白可溶性分析

1:蛋白Marker;2、3:洗滌后涵體總蛋白;4:SP陽離子柱純化后樣品。

圖3純化BDNF的SDS-PAGE檢測

#：P<0.05；##：P<0.01,與對照組比較。

圖4BDNF蛋白對PC12細胞活力的影響

3　討　　論

BDNF生物學(xué)功能十分廣泛，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元的可塑性、生長、生存及長期記憶。近幾年來有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，前體BDNF蛋白與其裂解產(chǎn)物共同參與神經(jīng)元的多種調(diào)控,但發(fā)揮出與其裂解產(chǎn)物相反的作用[7]。陳甲等[8]學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)前體BDNF蛋白能夠促進神經(jīng)元的凋亡。前體BDNF 蛋白單體含有 247 個氨基酸殘基，經(jīng)加工剪切后形成 119 個氨基酸殘基、相對分子質(zhì)量為14×103的成熟堿性蛋白，等電點為 9.99[9]。BDNF通過與受體(TrkB,p75NTR and sortilin)結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能[10]。

本實驗通過基因重組的方法將大鼠成熟BDNF的基因克隆至pET28a(+)載體中，并在大腸桿菌中獲得了表達，該質(zhì)粒在N端攜帶有編碼6個組氨酸的融合標簽序列，有利于親和層析純化。然而，實驗前期研究發(fā)現(xiàn)用鎳螯合親和層析(變性條件下)純化，目的蛋白不掛柱，可能原因是組氨酸融合標簽沒有暴露，后改用陽離子交換層析純化方法獲得了目的蛋白，SDS-PAGE和Western blot方法鑒別為目的蛋白。目的蛋白在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達后其表達量占菌體總蛋白的15%，以包涵體形式表達，直接在變性條件下利用陽離子交換層析純化獲得了高純重組BDNF 蛋白，經(jīng)復(fù)性后獲得了具有高生物學(xué)活性BDNF 蛋白。該方法利用BDNF高等電點特性，直接在變性條件下進行離子交換層析純化，建立了一種操作簡單，穩(wěn)定性高的制備BDNF的方法。此外，由于BDNF基因序列高度保守，因而本研究制備的BDNF蛋白可以用于不同物種之間的研究?？傊?，本研究通過基因技術(shù)獲得了重組BDNF 蛋白，為進一步探討B(tài)DNF 蛋白抗原性、作用機制和臨床治療運用奠定了基礎(chǔ)。

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Research on construction of prokaryotic expression vector of brain-derived neurotrophic factor and its biologic activity*

LiJianchun1,2,WangLi2,JiangNing1,WangQiong1Δ

(1.CollegeofPharmacology,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China;2.LaboratoryofOrganFibrosisProphylaxisandTreatmentbyIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine/ResearchCenterofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine/AffiliatedHospitalofTraditionalChineseMedicine,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China)

ObjectiveTo construct the prokaryotic expression plasmid pET28a(+)/BDNF and corresponding prokaryotic expression bacterium containing brain-derived neurotrophic factor(BDNF),and to research its biologic activity after IPTG induction expression.MethodsThe codon optimization was done according to Escherichia coli(E.coli) BL21(DE3) bias.The rat BDNF gen sequence was then artificially synthesized and the prokaryotic expression plasmid pET28a(+)was constructed.After identification by the restriction enzyme digestion (Bam HI,Hind Ⅲ)and DNA sequencing,E.coli BL21(DE3) was introduced.After IPTG induction expression,the recombinant protein expression was detected by SDS-PAGE,the BDNF protein antigenicity was indentified by Western blot with anti-BDNF specific antibody.MTT assay was used to evaluate the influence of BDNF protein on the PC12 cell viability.ResultsThe constructed plasmid of pET28a(+)/BDNF was 100% consistent with the designing sequence confirmed by restriction enzyme digestion and DNA sequencing identification;the engineering bacterium had a clear protein band at the relative molecular mass about 17×103after IPTG induction,Western blot displayed that the target protein could react with specific BDNF antibody;compared with the normal control group,the cell viability in the different concentrations of BDNF protein treatment groups was increased to some extent compared with the control group,in which 50 ng/mL BDNF treatment group showed the best effect.ConclusionThe prokaryotic expressing plasmid pET28a(+)/BDNF and corresponding prokaryotic expressing bacterium are constructed successfully and the BDNF protein expressed by this engineering bacterium has a good biologic activity.

brain-derived neurotrophic factor; prokaryotic expression; biologic activity

人因工程重點實驗室開放基金資助項目(HF2012-K-06)；四川省科技廳-瀘州市人民政府-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合科研資金項目(14JC01323-LH50)；國家科技重大專項(2012ZX09J12201)。作者簡介：李健春(1990-)，在讀碩士，主要從事中藥神經(jīng)、精神藥理與航天醫(yī)學(xué)研究?！?/p>

，E-mail:wqimplad@126.com。

R346

A

1671-8348(2016)20-2737-03

2015-12-11

2016-04-28)

·論著·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.20.001