張文強，丁　倩，張　娜,李月白

(1.鄭州大學(xué)護理學(xué)院臨床教研，鄭州 450052；2.河南省人民醫(yī)院胸外科1病區(qū)，鄭州 450003；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦外3病區(qū)，鄭州 450052;4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,鄭州 450003)

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microRNA-34a在大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型中的功能研究*

張文強1，丁倩2，張娜3,李月白4

(1.鄭州大學(xué)護理學(xué)院臨床教研，鄭州 450052；2.河南省人民醫(yī)院胸外科1病區(qū)，鄭州 450003；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦外3病區(qū)，鄭州 450052;4.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科,鄭州 450003)

目的探討微小RNA-34a(miR-34a)在碘乙酸鈉所致大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎模型中的表達變化，并初步明確其功能。方法選取30只雄性Wistar大鼠，左側(cè)膝蓋不注射碘乙酸鈉作為對照組，右側(cè)膝蓋注射碘乙酸鈉作為模型組；造模完成后檢測兩組大鼠關(guān)節(jié)液內(nèi)miR-34a表達水平的變化；分離兩組大鼠的膝關(guān)節(jié)軟骨細胞并進行原代培養(yǎng)，敲低miR-34a后，使用流式細胞儀測定細胞凋亡情況。結(jié)果模型組Makin評分為(5.09±1.35)分，對照組為(1.27±0.64)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，模型組中miR-34a在關(guān)節(jié)液和關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)的表達均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將miR-34a用它的反義互補片段敲低后，模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡受到明顯抑制(P<0.05)。結(jié)論miR-34a在碘乙酸鈉所致大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)液中表達升高，并且抑制miR-34a的表達會降低關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡率。

膝骨關(guān)節(jié)炎；關(guān)節(jié)液；微小RNA-34a；細胞凋亡

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見的退行性關(guān)節(jié)病，特征是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變。OA不僅造成關(guān)節(jié)軟骨的損傷，還可累及整個關(guān)節(jié)，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變、纖維化，以及關(guān)節(jié)面的損傷。膝關(guān)節(jié)作為人體負重較大的關(guān)節(jié)，是OA的好發(fā)部位[1-2]。然而，OA的治療尚局限于對癥治療。臨床上應(yīng)用非甾體類抗炎藥和激素等僅是減輕疼痛癥狀，不能逆轉(zhuǎn)OA的病理過程[3-4]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一種長度為18～25個核苷酸片段的內(nèi)源性非編碼的RNA，通過結(jié)合靶mRNA的3′UTR區(qū)來調(diào)控基因表達[5]。當(dāng)前基于miRNA治療的臨床試驗已應(yīng)用于多學(xué)科的多種疾病，具有很大的臨床診斷和治療潛力。而應(yīng)用于關(guān)節(jié)炎的類似治療比較少。在OA軟骨中，有研究發(fā)現(xiàn)miRNA可能參與OA的病理過程[6-10]。據(jù)報道，miRNA-34a(miR-34a)具有抗增殖能力，能夠調(diào)控細胞周期從G1到S的過渡[11]。此外，miR-34a可由p53誘導(dǎo)繼而引起細胞凋亡或者細胞周期停滯[12]。但是，miR-34a在膝OA中的作用并不明確。本實驗通過構(gòu)建大鼠膝OA模型研究miR-34a表達改變，通過探討miR-34a調(diào)控凋亡機制為OA的治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物來源8周齡的Wistar雄性大鼠30只，均來自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

1.2主要試劑miRNA反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒及相應(yīng)反轉(zhuǎn)錄引物購自南京凱基試劑公司；miR-34a熒光實時定量PCR(qRT-PCR)試劑盒及相應(yīng)PCR引物購自上海吉瑪生物制藥有限公司；鼠白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)購自上海恪敏生物科技有限公司；miR-34a的抑制劑及配套使用的轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博公司；細胞凋亡試劑盒(Annexin-V-FITC/PI雙染)購自江蘇碧云天公司。

1.3方法

1.3.1OA大鼠模型的建立選取8周齡的Wistar雄性大鼠30只，左側(cè)膝蓋不注射碘乙酸鈉，作為對照組；右側(cè)膝蓋注射碘乙酸鈉，作為模型組。大鼠腹腔注射10%水合氯醛進行麻醉，兩側(cè)膝關(guān)節(jié)備皮后75%乙醇常規(guī)消毒，屈曲45°，自髕骨下髕腱最外側(cè)進針，到達股骨髁后將注射器回抽2 mm，右側(cè)膝蓋注入0.1 mL 4%碘乙酸鈉溶液50 μL，進行骨關(guān)節(jié)炎模型誘導(dǎo)，左側(cè)膝蓋注射等體積的生理鹽水。膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉溶液2周后，將建模側(cè)膝關(guān)節(jié)與對側(cè)膝關(guān)節(jié)進行對比，建模側(cè)膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)腫脹及屈伸功能障礙，表示建模成功。在造模后8周處死大鼠，獲取大鼠關(guān)節(jié)樣品進行分析。

1.3.2大鼠模型評價10%水合氯醛0.3 mg/kg腹腔麻醉大鼠，取材前各組大鼠禁食12 h。取各組大鼠右側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨髁，觀察各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨大體形態(tài)學(xué)變化。隨后將關(guān)節(jié)軟骨置于4%多聚甲醛中固定，乙二胺四乙酸(EDTA)染色，光鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織結(jié)構(gòu)變化，并行關(guān)節(jié)軟骨Makin評分。

1.3.3大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的分離及培養(yǎng)自對照組大鼠的膝關(guān)節(jié)分離獲得關(guān)節(jié)軟骨細胞，將關(guān)節(jié)軟骨組織切為小片(<1 mm3)，經(jīng)0.2%胰蛋白酶和0.2% Ⅱ型膠原酶分別消化30 min和2 h。釋放的細胞在達氏修正依氏培養(yǎng)基(DMEM)/F12培養(yǎng)液中培養(yǎng)并添加10%胎牛血清(FBS)和抗菌藥物。初級細胞進行單層培養(yǎng)，細胞融合達到70%后傳代，將細胞以每孔3×103個細胞的密度接種于96孔板，細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)。

1.3.4核苷酸片段的轉(zhuǎn)染 細胞達到融合狀態(tài)后將其分為3組：空白對照組、隨機序列核酸組(Scramble組)及抑制劑組(Inhibitor組),分別處理。鎖核苷酸(locked nucleic acid，LNA)修飾的不同濃度DNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染按照制造商的方案使用Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司)進行。空白對照組，無質(zhì)粒載體僅加入脂質(zhì)體；Scramble組，將陰性對照的核苷酸片段轉(zhuǎn)染至細胞；Inhibitor組，將miRNA-34a的反向互補片段的抑制劑轉(zhuǎn)染至細胞。孵育完成后，將各組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合物分別加入已標(biāo)記的對應(yīng)孔板中，輕搖使其與培養(yǎng)基混合，均勻分布于孔板內(nèi)。再將細胞置于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育，6 h后換液，先用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后，換成含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。Scramble組及Inhibitor組加入終濃度為100 ng/mL的IL-1β誘導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡。

1.3.5細胞凋亡率的檢查采用膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-fluoresceinisothiocyanate/propidium iodide，AnnexinV-FICT/PI)雙染法檢測細胞凋亡率。細胞處理完畢后，用預(yù)冷的PBS沖洗細胞3次后，使用0.25%胰酶進行消化，1 000 r/min離心5 min收集細胞；向離心管中加入PBS，重復(fù)離心操作1次。向細胞中加入500 μL結(jié)合緩沖液，反復(fù)吹打制備單細胞懸液，并控制每組的細胞密度為每毫升1×106個。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，向每支流式管中加入5 μL Annexin V-FITC，避光保存30 min，上機前5 min向每支流式管中加入2.5 μL PI，并上機檢測，結(jié)果所示的右下象限和右上象限為凋亡細胞比例。

2　結(jié)　果

2.1兩組大鼠關(guān)節(jié)Makin評分比較模型組大鼠的Makin評分為(5.09±1.35)分，對照組為(1.27±0.64)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組大鼠膝關(guān)節(jié)OA關(guān)節(jié)液內(nèi)miR-34a的表達水平比較在體內(nèi)實驗中，對30只實驗大鼠左膝和右膝關(guān)節(jié)液中的miR-34a表達水平進行檢測。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組miR-34a在關(guān)節(jié)液內(nèi)表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示miR-34a可能是潛在的OA標(biāo)記物。見圖1。

*：P<0.05，模型組與對照組比較。

圖1兩組大鼠膝關(guān)節(jié)OA關(guān)節(jié)液內(nèi)miR-34a的表達水平比較

2.3兩組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中miR-34a的表達水平比較qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組關(guān)節(jié)軟骨細胞中miR-34a表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

*：P<0.05，與對照組比較。

圖2兩組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞中miR-34a的表達水平比較

2.4miR-34a抑制劑可敲低內(nèi)源性miR-34a的表達水平為了進一步研究miR-34a的生物學(xué)功能，使用miR-34a的反義互補片段(抑制劑)來敲低內(nèi)源性miR-34a的表達。qRT-PCR結(jié)果顯示，與Scramble組比較，轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑能夠有效地敲低內(nèi)源性miR-34a的表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

*：P<0.05，與Scramble組比較。

圖3各組關(guān)節(jié)軟骨細胞內(nèi)源性miR-34a的表達水平比較

2.5 敲低內(nèi)源性miR-34a的表達可抑制關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡OA中經(jīng)常伴隨有關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡的發(fā)生。使用流式細胞術(shù)檢測模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡，結(jié)果顯示，與空白對照組比較，Inhibitor組大鼠的細胞凋亡率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Scramble組則未見細胞凋亡率發(fā)生明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4　各組關(guān)節(jié)軟骨細胞的細胞凋亡率

3　討　論

miRNA可以通過調(diào)節(jié)特定miRNA的蛋白質(zhì)翻譯過程或與特定miRNA結(jié)合來調(diào)控基因表達，廣泛參與人體神經(jīng)分化、脂肪代謝、細胞增殖和凋亡等生理病理過程，是一種重要的調(diào)節(jié)因子。例如，let-7的表達可能通過引起RAS基因的高表達而在肺癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]；miRNA-143和miRNA-145在結(jié)腸癌中表達下降；miRNA在人類疾病例如白血病、病毒感染等疾病中扮演著重要角色[14-15]。

miR-34家族成員由p53基因誘導(dǎo)，通過靶向調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F transcrip tion factor 3，E2F3)、細胞周期素E2、細胞周期蛋白依賴激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)等，導(dǎo)致細胞凋亡、細胞周期停滯和衰老[10，16-17]。最近的研究證實，miR-34a是p53激活后誘導(dǎo)最顯著的miRNA，導(dǎo)致基因表達的改變。在人類癌癥中，miR-34a是p53的一個直接轉(zhuǎn)錄目標(biāo)，并且是p53腫瘤抑制網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分[17-18]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過直接靶向mRNA編碼的E2F3和顯著降低E2F3蛋白水平，誘導(dǎo)神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡，是一個潛在的腫瘤抑制劑。Tazawa等[18]證實，在結(jié)腸癌患者中miR-34a表達下調(diào)；研究標(biāo)明miR-34a是結(jié)腸癌疾病發(fā)展過程中的一個重要因子，未來可通過miR-34a來進行靶向治療[18]。

有研究證實，miRNA在OA的進展過程中發(fā)揮一定作用[7，18]。Yamasaki等[8]報道，miRNA-146在低級別OA關(guān)節(jié)軟骨中表達升高，其表達可由IL-1β的刺激誘導(dǎo)。Miyaki等[9]研究證實，OA關(guān)節(jié)軟骨中miR-140表達下降可能導(dǎo)致特征性O(shè)A異?；虮磉_模式。軟骨細胞凋亡是OA進展的一個主要因素。因此，本研究通過構(gòu)建大鼠膝OA模型來檢測miR-34a在OA軟骨的表達情況，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，模型組中miR-34a在關(guān)節(jié)液內(nèi)表達升高。另外，本研究進行細胞培養(yǎng)并建立細胞凋亡模型檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，加入IL-1β后，miR-34a表達升高；將miR-34a用它的反義互補片段敲低后，IL-1β引發(fā)的關(guān)節(jié)軟骨細胞的凋亡受到明顯抑制。

綜上所述，本實驗證實對miR-34a作用靶點進行沉默，可抑制軟骨細胞凋亡，達到保護軟骨、延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的作用，為OA的治療提供進一步的理論支持。

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Study on function of microRNA-34a in rat model of knee osteoarthritis*

ZhangWenqiang1，DingQian2，ZhangNa3，LiYuebai4

(1.ClinicalSectionofTeachingandResearch,NursingCollegeofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;2.FirstWard,DepartmentofThoracicSurgery,HenanProvincialPeople′sHospital,Zhengzhou,Henan450003,China；3.ThirdWard,DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China;4.DepartmentofOrthopedics,FirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450003,China)

ObjectiveTo explore the expression of microRNA-34a(miR-34a) in sodium iodoacetate-induced rat model of osteoarthritis rat model and to initially clarify its function.MethodsThirty male Wistar rats were selected.The right knees were injected with sodium iodoacetate (model group) and the left knees served as the control group without injecting by sodium iodoacetate.The expression levels of miR-34a in the synovial fluid and articular chondrocytes were compared between two groups after constructing the model.Articular chondrocytes in the two groups were separated for conducting the primary culture,after miR-34a knockdown,the flow cytometry was used to determine cell apoptosis.ResultsThe Makin score in the model group was(5.09±1.35)points,which was (1.27±0.64)points in the control group,the difference had statistical significance(P<0.05).Compared with the control group,the expression levels of miR-34a in the synovial fluid and articular chondrocytes in the model group were increased,the difference was statistically significant(P<0.05).After the miR-34a knockdown by using its complementary antisense fragment,articular chondrocytes apoptosis in the model group was significantly inhibited(P<0.05).ConclusionThe expression of miR-34a in the synovial fluid of sodium iodoacetate-induced knee osteoarthritis is increased,moreover inhibiting the microRNA-34a expression could reduce the apoptotic rate of articular chondrocytes in osteoarthritis rat.

knee osteoarthritis；synovial fluid；microRNA-34a；apoptosis

論著·基礎(chǔ)研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.003

國家自然科學(xué)基金資助項目(81071520)。作者簡介：張文強(1978-)，講師，碩士，主要從事外科學(xué)研究。

R684.3

A

1671-8348(2016)19-2599-03

2016-01-08

2016-03-13)