張永欣，張　璐

(煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院婦科，山東 煙臺(tái) 264001)

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人乳頭瘤病毒E6/E7mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的意義

張永欣，張璐

(煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院婦科，山東 煙臺(tái) 264001)

[摘要]目的評(píng)估人乳頭瘤病毒(HPV)E6/E7mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的意義。方法對(duì)3 381名行機(jī)會(huì)性宮頸癌篩查的女性分別行液基細(xì)胞學(xué)(TCT)、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢查，其中371例結(jié)果可疑者行陰道鏡下活檢。分別記錄其TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢測(cè)結(jié)果及活檢病理結(jié)果等，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果人群篩查中HPV E6/E7mRNA的總陽(yáng)性率為16.47%(557/3 381)；炎癥患者與宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)Ⅰ級(jí)患者HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率分別為60.73%(116/191)和68.60%(83/121)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.98，P>0.05)；炎癥患者與CIN Ⅰ級(jí)患者mRNA表達(dá)量分別為7 781.26±2 686.13和7 498.47±2 860.08 copy/mL，亦無(wú)顯著差異(t=0.07，P>0.05)，而CIN Ⅱ-Ⅲ級(jí)患者HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率為89.10%(49/55)，mRNA表達(dá)量為30 716.66±10 281.89，均顯著高于炎癥患者(χ2=15.55，t=2.19)及CIN Ⅰ患者(χ2=8.47，t=2.18)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；不同活檢病理分級(jí)(≤CIN Ⅰ或≥CIN Ⅱ)中，只有HPV E6/E7mRNA的檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異(χ2=15.45，P<0.05)；對(duì)于宮頸CIN Ⅱ以上病變的診斷，HPV E6/E7mRNA的敏感度最高(89.83%)；TCT特異度最高(62.18%)。HPV E6/E7mRNA最佳工作點(diǎn)為1 637.48copy/mL，其診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的敏感度為79.70%，特異度為63.50%。ROC曲線下面積為0.75(P<0.05)。結(jié)論HPV E6/E7mRNA檢測(cè)診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變具有較高的敏感性和特異性，在宮頸癌篩查具有較為重要的意義。

[關(guān)鍵詞]人乳頭瘤病毒；E6/E7mRNA；宮頸上皮內(nèi)瘤變；宮頸癌篩查

在我國(guó)，宮頸癌仍是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。目前，宮頸癌篩查方法眾多，如何利用有效的醫(yī)療資源最大限度的減少宮頸癌的發(fā)生是目前臨床蒞待解決的問(wèn)題。眾所周知，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN))發(fā)生的重要原因，也是CIN進(jìn)展為宮頸癌的重要因素[2]。已有很多研究證實(shí)，發(fā)生HPV感染后，隨著宮頸病變的加重，HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率也隨之增加[3-4]。本文通過(guò)對(duì)HPV E6/E7mRNA檢測(cè)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用進(jìn)行前瞻性研究，并與另外兩種最常見(jiàn)的宮頸癌篩查方法進(jìn)行對(duì)照分析，以期尋找最佳的宮頸癌篩查方案，從而最大程度地減少醫(yī)療資源浪費(fèi)并提高宮頸癌的篩查效率。

1資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取2013年7月至2015年6月在煙臺(tái)市煙臺(tái)山醫(yī)院婦科門(mén)診或婦科病房行機(jī)會(huì)性宮頸癌篩查的女性，排除既往曾接受過(guò)治療的CIN或?qū)m頸癌患者、妊娠患者、患惡性、自身免疫疾病或正在接受免疫抑制治療的患者，對(duì)3天內(nèi)無(wú)性生活、未行陰道上藥/沖洗的患者，分別行液基細(xì)胞學(xué)(thinprep cytologic test，TCT)、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢查。

滿足如下任意條件的患者均在知情同意下行陰道鏡下活檢：①任何TCT結(jié)果為不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance，ASC-US)及以上的患者；②HPV DNA分型檢測(cè)提示為16型或18型感染的患者；③HPV DNA分型檢測(cè)提示為其它高危亞型感染持續(xù)1年以上陽(yáng)性的患者；④TCT和高危型HPV DNA分型檢測(cè)為陰性但HPV E6/E7mRNA持續(xù)半年以上陽(yáng)性的患者。

記錄每一個(gè)研究對(duì)象年齡、TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA檢測(cè)結(jié)果及采樣時(shí)間，活檢前陰道鏡診斷，活檢及環(huán)形電切術(shù)(loop electrosurgical excision procedure，LEEP)病理結(jié)果及操作時(shí)間等。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本制備

采用新柏氏專用宮頸取樣毛刷，緊貼宮頸口略微用力并順時(shí)針旋轉(zhuǎn)7～8圈，充分留取宮頸管內(nèi)和鱗柱上皮交界處的宮頸脫落細(xì)胞，將刷頭放入專用細(xì)胞保存液中于4℃保存、1周內(nèi)檢測(cè)。

1.2.2各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

TCT采用全自動(dòng)液基細(xì)胞離心制片機(jī)(美國(guó)新柏氏)進(jìn)行制片，染色后鏡檢；HPV DNA采用廣東凱普生物科技股份有限公司的人乳頭瘤病毒(HPV)基因分型檢測(cè)試劑盒將TCT檢查剩余的1/2標(biāo)本液(1號(hào)液)進(jìn)行HPV檢測(cè)及基因分型；HPV E6/E7mRNA采用科蒂亞(新鄉(xiāng))生物技術(shù)有限公司的宮頸穩(wěn)態(tài)檢測(cè)專用試劑盒通過(guò)信號(hào)擴(kuò)增法對(duì)TCT檢查剩余的另外1/2標(biāo)本液(2號(hào)液)進(jìn)行定量檢測(cè)。所有檢測(cè)均在不知曉其它檢測(cè)結(jié)果的前提下按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3病理學(xué)檢查

陰道鏡下活檢由經(jīng)驗(yàn)豐富的中、高年資醫(yī)師完成?；顧z病理結(jié)果根據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)分為：陰性、CIN Ⅰ、CIN Ⅱ、CIN Ⅲ和微小浸潤(rùn)癌。所有宮頸活檢病理結(jié)果均采用雙盲法由2個(gè)有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生共同確定，若診斷不一致，則由兩位病理醫(yī)師在雙頭鏡下達(dá)成共識(shí)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分別統(tǒng)計(jì)不同病理級(jí)別中，TCT、HPV DNA及HPV E6/E7mRNA的檢測(cè)結(jié)果，用卡方檢驗(yàn)分析不同病理級(jí)別TCT、HPV DNA分型及HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率有無(wú)差別，比較不同篩查方法對(duì)于宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變的診斷的敏感度和特異度。通過(guò)繪制ROC曲線得知HPV E6/E7mRNA定量的最佳臨界值，并進(jìn)一步評(píng)價(jià)其敏感性和特異性。

2結(jié)果

2.1人群篩查情況

共有3 381名進(jìn)行機(jī)會(huì)性宮頸癌篩查的女性入組，年齡20～73歲，平均年齡31.24±9.67歲。其中HPV E6/E7mRNA的總陽(yáng)性率為16.47%(557/3 381)，HPV E6/E7mRNA定量值<1 000的有184例，定量值1 000～3 000的有176例，定量值3 000～10 000的有128例，定量值≥10 000的有69例。TCT的陽(yáng)性率(ASCUS及以上)為4.20%(142/3 381)。HPV DNA檢測(cè)高危亞型感染率為23.63%(799/3 381)，其中178例存在HPV16型或18型感染，127例為其它高危亞型感染且持續(xù)陽(yáng)性1年以上。36例TCT和高危型HPV DNA分型檢測(cè)為陰性，但HPV E6/E7mRNA持續(xù)陽(yáng)性半年以上。

2.2不同級(jí)別宮頸病變HPV E6/E7mRNA表達(dá)情況

371例患者接受陰道鏡下活檢，年齡20～66歲，平均年齡38.25±10.42歲。比較炎癥患者與CIN Ⅰ患者HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率(χ2=1.98)和mRNA表達(dá)量(t=0.07)均無(wú)顯著差異(P>0.05)，而CIN Ⅱ-Ⅲ患者HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率和mRNA表達(dá)量均顯著高于炎癥患者(χ2=15.55，t=2.19)及CIN1患者(χ2=8.47，t=2.18)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

注：▲為炎癥患者與CINⅠ患者比較，★為CIN Ⅱ-Ⅲ與炎癥患者比較，◆為CIN Ⅱ-Ⅲ與CIN Ⅰ患者比較。

2.3 HPV E6/E7mRNA表達(dá)與TCT及HPV分型檢測(cè)結(jié)果比較

371例活檢病人中，有142例是TCT陽(yáng)性患者，其中67.61%(96/142)HPV E6/E7mRNA陽(yáng)性；305例HPV DNA分型檢查為高危型陽(yáng)性的患者有67.87%(207/305)HPV E6/E7mRNA陽(yáng)性。其與宮頸活檢病理結(jié)果的關(guān)系見(jiàn)表2，不同活檢病理分級(jí)(≤CIN I或≥CIN II)只有HPV mRNA的檢測(cè)結(jié)果有顯著性差異。3種篩查方法對(duì)于宮頸CIN II以上病變的診斷，敏感度:HPV mRNA較HPV DNA檢測(cè)略高，TCT最差；特異度：TCT最佳；HPV mRNA次之，HPV DNA最差，見(jiàn)表3。

2.4 ROC曲線分析

以組織病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，≥CIN II者為陽(yáng)性，

表2不同篩查方法檢測(cè)結(jié)果與宮頸活檢病理結(jié)果的關(guān)系[n(%)]

Table 2　The relationship between the detection results of different screening methods and the pathological results of cervical biopsy[n(%)]

表3不同篩查方法對(duì)于宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的診斷的敏感度和特異度比較

Table 3Comparison of the sensitivity and specificity of different screening methods in the diagnosis of CIN

篩查方法敏感度(%)特異度(%)TCT40.6762.18HPVDNA88.1418.91HPVmRNA89.8336.22

圖1HPV E6/E7mRNA診斷宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)病變的ROC曲線

Fig.1The ROC curve of HPV E6/E7 mRNA test in the diagnosis of high grade CIN

3討論

3.1 HPV E6/E7mRNA表達(dá)與宮頸病變病理分級(jí)的關(guān)系

眾所周知，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的首要因素，99.7%的宮頸癌標(biāo)本中均可檢測(cè)到HPV。HPV基因編碼包括6個(gè)早期開(kāi)放讀碼框(E1、E2、E3、E5、E6和E7)和2個(gè)晚期讀碼框(L1和L2)。大量研究已證實(shí)，HPV早期讀碼框中的E6/E7基因才是導(dǎo)致女性罹患宮頸癌的主要原因。發(fā)生高危型HPV感染后，病毒DNA一旦與宿主細(xì)胞DNA整合，其病毒的主要致癌基因E6、E7將不受控制地高度表達(dá)，產(chǎn)生E6、E7癌蛋白，然后與宿主細(xì)胞的一些細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，進(jìn)而發(fā)生癌變。由于DNA攜帶的遺傳信息需轉(zhuǎn)錄給mRNA后再翻譯成蛋白質(zhì)，因此通過(guò)測(cè)定癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的量，可以直接反映癌基因的活性，達(dá)到檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)的目的[5-6]。當(dāng)前HPV的分子診斷方法主要依賴于對(duì)HPV DNA的檢測(cè)。自2003年美國(guó)食品與藥品管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)就批準(zhǔn)將HPV DNA檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查用于30歲以上女性的宮頸癌篩查。這種聯(lián)合篩查方式顯著降低了宮頸癌的發(fā)生率。然而，事實(shí)上只有很少一部分HPV感染會(huì)導(dǎo)致宮頸癌或?qū)m頸癌前病變。HPV DNA檢測(cè)作為病因檢測(cè)，無(wú)法對(duì)病毒感染階段及病毒致癌活性進(jìn)行判斷，其作為宮頸癌篩查手段敏感度高但特異度低，造成很大程度的過(guò)度檢查和過(guò)度治療，這個(gè)現(xiàn)象在HPV感染較常見(jiàn)的30歲以下的年輕女性中尤為常見(jiàn)，且危害更大[7]。因此，臨床迫切需要一種更特異的生物標(biāo)記物。目前，很多學(xué)者已將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)到宮頸癌及癌前病變中高危型HPV E6/E7mRNA的表達(dá)，已知HPV E6/E7mRNA在宮頸癌及癌前病變中陽(yáng)性率明顯升高，但其表達(dá)情況與不同CIN病理分級(jí)的關(guān)系尚無(wú)定論。

本研究中炎癥病變和CIN Ⅰ病變中HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率分別為60.73%和68.60%，mRNA表達(dá)量平均值分別為7 781.26copy/mL和7 498.47copy/mL；而CIN Ⅱ-Ⅲ和宮頸浸潤(rùn)癌的患者中，HPV E6/E7mRNA的陽(yáng)性率分別為89.10%和100.00%，mRNA表達(dá)量平均值分別為30 716copy/mL和 6 649.05copy/mL，可見(jiàn)在宮頸病變的進(jìn)展過(guò)程中，其mRNA的量在進(jìn)入高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesions，HSIL)階段會(huì)有明顯的升高，進(jìn)入浸潤(rùn)癌階段卻有明顯回落趨勢(shì)，由于本研究中宮頸浸潤(rùn)癌的病例較少，二者的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具體機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。但HPV E6/E7mRNA檢測(cè)對(duì)于宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)瘤變的診斷無(wú)疑有非常重要的意義。

3.2宮頸癌篩查中不同檢查方法的意義比較

綜合比較TCT、HPV DNA和HPV E6/E7mRNA，對(duì)于宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變及宮頸癌的診斷，HPV E6/E7mRNA診斷的靈敏度略高于HPV DNA，特異度也明顯高于HPV DNA，與既往研究相近[3-4]。尤其是利用ROC曲線分析后，以HPV E6/E7mRNA表達(dá)量1 637.48copy/mL作為臨界值，診斷宮頸高級(jí)別病變敏感度為79.70%，略降低，但特異度明顯升高，達(dá)63.50%，超過(guò)TCT檢測(cè)的特異度。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)36例TCT和高危型HPV DNA分型檢測(cè)為陰性，但HPV E6/E7mRNA持續(xù)陽(yáng)性半年以上的患者，有15例活檢病理分級(jí)在HSIL以上，在臨床中我們應(yīng)對(duì)這部分病人予以充分重視。

綜上所述，HPV E6/E7mRNA可有效地提高宮頸癌篩查的敏感性和特異性，從而減少過(guò)度檢查和過(guò)度治療，也能明顯減輕病人的心理負(fù)擔(dān)，尤其對(duì)于年輕女性的宮頸癌篩查具有非常重要的意義。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：張忠明]

[收稿日期]2016-04-27

[基金項(xiàng)目]煙臺(tái)市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2015YD008)

[作者簡(jiǎn)介]張永欣(1966-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事宮頸病變研究。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.07.010

[中圖分類號(hào)]R711.4

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1673-5293(2016)07-0816-03

Significance of human papillomavirus E6/E7mRNA detection in cervical cancer screening

ZHANG Yong-xin, ZHANG Lu

(Department of Gynecology, Yantaishan Hospital, Shandong Yantai 264001, China)

[Abstract]Objective To evaluate the significance of human papillomavirus (HPV) E6/E7mRNA detection in cervical cancer screening. Methods A total of 3 381 women who had taken an opportunistic cervical cancer screening received thin-prep cytologic test (TCT), HPV DNA and HPV E6/E7mRNA examinations. Among them, 371 cases with suspicious results underwent colposcopy guided biopsy. The results of their TCT, HPV DNA and HPVE6/E7mRNA tests and the pathologic results were recorded and analyzed by SPSS19.0 software. Results The total positive rate of the HPV E6/E7mRNA test was 16.47% (557/3 381). The positive rate of HPV E6/E7mRNA in patients with inflammation and cervical intraepithelial neoplasia Ⅰ(CIN Ⅰ) was 60.73% (116/191) and 68.60% (83/121), respectively. The difference was not significant (F=1.98, P>0.05). The mRNA expression levels of patients with inflammation and patients with CIN Ⅰ was 7 781.26±2 686.13 and 7 498.47±2 860.08 copy/mL, respectively. The difference was also not significant (t=0.07, P>0.05). However, the positive rate and mRNA expression levels of CIN Ⅱ-Ⅲ patients (89.10% [49/55]; 30 716.66±10 281.89 copy/mL) were significantly higher than those of patients with inflammation (χ2=15.55, t=2.19) and CIN Ⅰ patients (χ2=8.47, t=2.18). The differences were all statistically significant (all P<0.05). Only HPV E6/E7mRNA test results were significantly different (χ2=15.45,P<0.05) in patients with different biopsy grade (≤CIN Ⅰ or ≥CIN Ⅱ). HPV E6/E7mRNA showed its highest sensitivity (89.83%) while TCT had the highest specificity (62.18%) in the diagnosis of CIN Ⅱ and above. The optimal operating point of HPV E6/E7mRNA was 1 637.48copy/mL. The sensitivity in diagnosing high degree of CIN lesions was 79.70% and the specificity was 63.50%. The area under ROC curve was 0.75 (P<0.05).Conclusion HPV E6/E7mRNA test can detect and diagnose CIN lesions with relatively high sensitivity and specificity. Thus, it has important significance in cervical cancer screening.

[Key words]human papilloma virus (HPV); E6/E7mRNA; cervical intraepithelial neoplasia (CIN); cervical cancer screening