高星愛(ài)，李忠和，王 鑫，趙新穎，解 嬌，祝延立，張永鋒

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130033)

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4株降解低溫糞污水芽孢桿菌的分離·鑒定及其降解效率研究

高星愛(ài)，李忠和，王 鑫，趙新穎，解 嬌，祝延立*，張永鋒*

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130033)

[目的]獲得可在低溫環(huán)境下高效降解糞污水的芽孢桿菌。[方法]從大型養(yǎng)殖場(chǎng)及活性污泥、下水道等低溫環(huán)境下采集樣品，分離并篩選耐冷菌株，通過(guò)掃描電鏡觀察獲得菌株的形態(tài)特征，分析其16S rRNA基因測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步確定菌株的菌屬；對(duì)其進(jìn)行鑒定后將其添加到污水生物反應(yīng)器中對(duì)豬場(chǎng)糞污水進(jìn)行凈化，分析糞污水中化學(xué)需氧量(COD)、生物需氧量(BOD)及溶解氧(DO)變化情況。[結(jié)果]這4株菌均為蠟樣芽孢桿菌；在糞污水里添加這4株菌的復(fù)合菌液后，糞污水的COD值從5 585.40 mg/L降至1 093.97 mg/L，去除率達(dá)80.40%；BOD值從680.00 mg/L降至600.00 mg/L，去除率為11.76%；DO值大幅度上升，增加率為75.00%。[結(jié)論]復(fù)合菌在糞污水處理方面表現(xiàn)出了較高的降解能力，可為污染物生物修復(fù)提供優(yōu)良的菌種資源，具有廣闊的應(yīng)用前景。

蠟樣芽孢桿菌；分離；鑒定；污水凈化

隨著工業(yè)化水平的提高及養(yǎng)豬業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)生大量的糞便、糞水，其對(duì)環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。有研究表明，每生產(chǎn)1頭肥豬(180 d，體重100 kg)就會(huì)產(chǎn)生約4 t的糞便污水，約含120～150 kg的總固體(TS)[1]。豬場(chǎng)廢水主要包括豬場(chǎng)糞尿及沖洗廢水，屬于高濃度的有機(jī)廢水，氨氮和固體懸浮物(SS)的含量均很高，排放廢水中生物需氧量(BOD)高達(dá)2 000～8 000 mg/L，化學(xué)需氧量(COD)高達(dá)5 000～20 000 mg/L，且SS濃度超過(guò)排放標(biāo)準(zhǔn)的10倍[2]。利用微生物菌劑治理水環(huán)境既不會(huì)消耗外界能量，又不會(huì)產(chǎn)生二次污染。投加的微生物制劑中的有益菌類可將水體的污染物作為生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，將其分解成水、二氧化碳、氮?dú)獾葻o(wú)害的物質(zhì)歸還至環(huán)境中，達(dá)到增加溶解氧(DO)、降低磷酸鹽及抑制有害微生物繁殖的效果[3]。大量研究表明，污染物的降解單靠純菌株的作用難以徹底進(jìn)行，它們的降解過(guò)程是復(fù)雜的生物化學(xué)過(guò)程，需要多種微生物的共同作用才能完成[4]。鄒文娟等[5]在常溫下利用光合細(xì)菌和枯草芽孢桿菌的混合菌處理污水，結(jié)果顯示COD去除率為58.73%；DO增加率為87.75%。梁雷等[6]在水溫為15～20 ℃時(shí)利用微生物處理污水中的污染物，結(jié)果顯示COD平均去除率為64.2%。國(guó)外已研制出多種可應(yīng)用于污水處理的微生物菌劑，如美國(guó)的Clear-Flo系列、利蒙LLMO系列微生物制劑以及日本研制的EM制劑等[7-9]。蠟樣芽孢桿菌是普遍存在于自然界的一類革蘭氏陽(yáng)性菌，其可產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制有害微生物的繁殖，能分泌蛋白酶、產(chǎn)酸酶、淀粉酶和半纖維素酶等胞外酶；另外，它還能有效分解水體高分子的多糖、蛋白質(zhì)等污染物，在水環(huán)境中能形成優(yōu)勢(shì)菌群，加速有機(jī)物降解，改善生態(tài)環(huán)境[10]。目前，蠟樣芽孢桿菌降解糞污水的研究較少，尤其是以蠟樣芽孢桿菌復(fù)合菌液降解糞污水尚無(wú)報(bào)道。鑒于此，筆者從大型養(yǎng)殖場(chǎng)及活性污泥、下水道等低溫環(huán)境下采集樣品，分離并篩選耐冷菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定后將其添加到污水生物反應(yīng)器中對(duì)豬場(chǎng)糞污水進(jìn)行凈化，研究其對(duì)低溫糞污水的降解效率，旨在構(gòu)建出適合低溫條件的、專一高效的污水降解微生物復(fù)合菌劑，并為該菌劑的實(shí)際應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1樣品。樣品采集于低溫環(huán)境下的大型養(yǎng)殖場(chǎng)及活性污泥、下水道等。

1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：酵母粉 5 g/L，蛋白胨 10 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂粉 15 g/L，去離子水1 000 mL，pH 7.0。液體培養(yǎng)基不加瓊脂。

1.1.3污水。污水為大型養(yǎng)殖場(chǎng)提供的新鮮糞污水。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株分離。將采集的樣品置于濃度為0.9%的生理鹽水中振蕩30 min，沉淀后取上清液，利用稀釋法涂布于LB基礎(chǔ)培養(yǎng)基上[11]，在低溫10 ℃條件下培養(yǎng)并篩選單菌落。1.2.2菌株篩選。利用平板分離法篩選獲得特征菌株。將這些功能菌分別置于不同的低溫環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察各菌株生長(zhǎng)情況，并測(cè)定培養(yǎng)液的細(xì)胞生物量。在20 ℃溫度下挑選出細(xì)胞生長(zhǎng)量OD660 nm>1.2的菌株。細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定參照高星愛(ài)等[12]的方法。細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用平板計(jì)數(shù)法，按5%比例將菌株接入培養(yǎng)液中，在30 ℃下培養(yǎng)1～2 d，取菌液0.1 ml，加入0.9 ml滅菌水，振蕩混勻，即為10-1倍稀釋液，依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9和10-10倍菌液，最后分別取10-8、10-9和10-10這3個(gè)稀釋梯度的菌液0.1 mL，用無(wú)菌玻璃涂布器均勻涂布于固體LB培養(yǎng)基上，重復(fù)3次，置30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，觀察并記錄每天的菌數(shù)(CFU/mL)。

1.2.3菌株鑒定。

1.2.3.1掃描電子顯微鏡(SEM)分析。挑取在培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株于滅菌的載玻片上，用滅菌的蓋玻片蓋住一小部分，用前固定液(濃度0.025 mol/L、pH 6.8磷酸緩沖液配置的4%濃度的戊二醛)于4 ℃下固定2 h，用濃度為0.025 mol/L、pH為6.8的磷酸緩沖液洗1 h，共洗4次，間隔時(shí)間為15 min，1%鋨酸固定2 h，水洗5 min，依次用濃度為50%、60%、70%、80%、90%的酒精脫水10 min，再分別用濃度為95%、100%的丙酮干燥10 min后再以乙酸戊酯干燥15 min，噴金，采用GSM-5600型號(hào)的掃描電子顯微鏡進(jìn)行掃描，樣品大小顯示2 μm[12]。

1.2.3.2分離篩選獲得的菌株16S rRNA同源性比較。利用細(xì)菌RNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，正向和反向引物分別為5′-ACGGCTACCT TGTTACGACT-3′和5′-CCCACTGCCTCCCGTAAGGAGT-3′。PCR產(chǎn)物克隆利用pGEM-T Easy 載體(Pro-mega，USA)，進(jìn)一步確定發(fā)育地位，將16S rRNA基因的核苷酸序列輸入NCBI網(wǎng)站，下載同源性較高的序列進(jìn)行測(cè)序。

1.3菌株降解低溫糞污水能力測(cè)定將篩選得到的菌種培養(yǎng)擴(kuò)繁，等份混合成復(fù)合菌液接種于新鮮糞污水中，在20 ℃下處理20 d，以不接種菌液的糞污水為對(duì)照，測(cè)定污水中COD值、BOD值及DO值的變化，得出復(fù)合菌液降解糞污水

的能力。COD與BOD的數(shù)據(jù)由中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所提供，DO的測(cè)定采用 JPB-607A 便捷式溶解氧儀進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1菌株的分離與篩選結(jié)果利用平板分離法篩選獲得20多種特征菌株，分別置于不同的低溫環(huán)境下培養(yǎng)，觀察各菌株生長(zhǎng)情況，并測(cè)定培養(yǎng)液的細(xì)胞生物量。在20 ℃溫度下細(xì)胞生長(zhǎng)量OD660 nm>1.2的菌株有4株，分別為NKY-16、YCH-10、GZ-41、FJT-84。

2.2低溫條件下菌株細(xì)胞生長(zhǎng)的分析結(jié)果由圖1可以看出這4種菌株在4～25 ℃的不同反應(yīng)溫度下的細(xì)胞生長(zhǎng)量，隨著溫度的升高，其生長(zhǎng)量均表現(xiàn)為上升趨勢(shì)，在20 ℃溫度條件下OD660 nm值表現(xiàn)為1.2～1.6，比其他溫度條件下的生長(zhǎng)量高。但在超過(guò)20 ℃之后，其生長(zhǎng)量隨之減少。因此選擇20 ℃為這4種菌株的最適生長(zhǎng)溫度。在菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，菌株NKY-16、YCH-10、GZ-41、FJT-84的細(xì)胞生長(zhǎng)菌體密度分別為(5.6±0.1)×108、(2.9±0.8)×109、(8.2±0.6)×109、(9.1±0.4)×109CFU/mL。

圖1　反應(yīng)溫度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1　Effects of reaction temperature on the growth curve of cells

2.3菌株的鑒定結(jié)果

2.3.1形態(tài)學(xué)觀察。分離篩選得到的4種耐冷芽孢桿菌的菌落在LB培養(yǎng)基呈白色，菌落大，表面粗糙，扁平，不規(guī)則。革蘭氏染色呈陽(yáng)性。

2.3.2掃描電子顯微鏡分析結(jié)果。掃描電子顯微鏡照片見(jiàn)圖2。觀察結(jié)果顯示，菌體細(xì)胞為桿狀，產(chǎn)芽孢，芽孢圓形或柱形，包囊無(wú)明顯膨大。

2.3.3分離菌株的16S rRNA 鑒定結(jié)果。利用16S rRNA對(duì)菌株進(jìn)行測(cè)序后，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。從比對(duì)結(jié)果來(lái)看，分離篩選得到的菌株GZ-41與模式種Bacilluscereus. SH 01(屬于蠟樣芽胞桿菌)的相似性達(dá)99%，菌株 NKY-16、YCH-10、FJT -84均與Bacilluscereus. G9667(屬于蠟樣芽胞桿菌)的相似性達(dá)99%，說(shuō)明獲得的4種菌株與蠟樣芽胞桿菌有很高的相似性。結(jié)合掃描電子顯微鏡結(jié)果與《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]分析，將4種菌株鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacilluscereus種屬)。

2.4菌株降解糞污水的效果結(jié)果表明，添加菌液的糞污水的COD值從5 585.40 mg/L降至1 093.97 mg/L，去除率達(dá)80.40%；BOD值從680.00 mg/L降至600.00 mg/L，去除率為11.76%，DO增加率為75.00%；對(duì)照的COD值從5 585.40 mg/L降至2 831.80 mg/L，去除率為49.30%；BOD值從680.00 mg/L降到633.00 mg/L，去除率為6.90%，DO增加率為47.00%。與對(duì)照比較，復(fù)合菌表現(xiàn)出了較高的降解能力，同時(shí)也表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物修復(fù)能力，其處理低溫糞污水效果明顯。

3　結(jié)論

該研究從低溫環(huán)境中篩選獲得4種菌株并利用菌株之間的協(xié)同作用構(gòu)建微生物復(fù)合菌，通過(guò)掃描電子顯微鏡分析及16S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，可以鑒定4種菌株為蠟樣芽孢桿菌。復(fù)合菌在糞污水處理方面表現(xiàn)出了較高的降解能力，可為污染物生物修復(fù)提供優(yōu)良的菌種資源，但其作用機(jī)理、生化特征等方面的研究還存在一些不足，需深入研究復(fù)合菌之間的最佳配比及優(yōu)化條件等，構(gòu)建出適合低溫污水降解的專一有效微生物復(fù)合菌劑，同時(shí)結(jié)合糞污水厭氧消化技術(shù)，最終將其應(yīng)用于糞污水低溫處理系統(tǒng)。

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Isolation and Identification of Four Bacillus Species with Degradation of Fecal Sewage at Low Temperature and Their Degradation Efficiency

GAO Xing-ai, LI Zhong-he, ZHU Yan-li*, ZHANG Yong-feng*et al

(Jilin Academy of Agricultural Sciences, Changchun, Jilin 130033)

[Objective] To obtain Bacillus which could efficiently degrade fecal sewage at low temperature. [Method] Samples were collected from the large farms, activated sludge, sewer and other low temperature environment. Cold resistant strains were isolated and screened. Observation of scanning electron microscope could obtain the morphological characteristics of strains. The 16S rRNA gene sequence was analyzed. Phylogenetic tree was constructed. And the bacterial genus were preliminarily detected. After identified, they were added into wastewater biological reactors to purify fecal sewage in pig farm. chemical oxygen demand(COD), biological oxygen demand (BOD) and dissolved oxygen (DO) were analyzed in the fecal sewage. [Result] The four strains all belonged toBacilluscereus. After adding the composite solution of four strains into fecal sewage, COD value declined from 5 585.40 to 1 093.97 mg/L with the removal rate of 80.40%; BOD value reduced from 680.00 to 600.00 mg/L, with the removal rate of 11.76%. DO value enhanced greatly with the increasing rate reaching 75.00%. [Conclusion] The compound bacteria shows relatively high degradation ability, provides high-quality strain resources for the bio-remediation of pollutants, and has broad application prospect.

Bacilluscereus; Isolation; Identification; Sewage purification

2013年吉林省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20130206108SF，201302060 53NY)；吉林省科技發(fā)展計(jì)劃產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目(20130305041NY)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD14B05)。

高星愛(ài)(1978-)，女，吉林延吉人，副研究員，博士，從事能源微生物與生物質(zhì)資源綜合利用研究。*通訊作者，祝延立，研究員，碩士，從事生物質(zhì)資源綜合利用研究；張永鋒，研究員，博士，從事農(nóng)村生態(tài)與循環(huán)農(nóng)業(yè)研究。

2016-05-11

S 181

A

0517-6611(2016)17-083-03