王銀龍，單鐵英

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芪歸健腦顆粒抑制老年癡呆大鼠海馬組織iNOS表達(dá)及NO含量的影響

王銀龍1，單鐵英2

1.河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院(河北邯鄲 056002)，E-mail：hdwyl0812@163.com；2.河北工程大學(xué)

摘要：目的研究芪歸健腦顆粒對(duì)老年性癡呆(AD)大鼠海馬組織誘導(dǎo)型一氧化氮分酶(iNOS)表達(dá)及一氧化氮(NO)含量的影響。方法SD大鼠海馬內(nèi)注射Aβ25-35，制備AD大鼠模型，實(shí)驗(yàn)分為3組：假手術(shù)組、模型組和治療組。治療組在造模前后用芪歸健腦顆粒灌胃。用Morris水迷宮測(cè)定各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；Western blot測(cè)定各組大鼠海馬組織iNOS蛋白表達(dá)；硝酸還原酶法檢測(cè)各組大鼠海馬組織NO含量。結(jié)果模型組的逃避潛伏期延長(zhǎng)，單位時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)減少，海馬組織iNOS的表達(dá)水平及NO含量均升高，與假手術(shù)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療組的逃避潛伏期縮短，單位時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)增多，iNOS表達(dá)水平及NO含量下降，與模型組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論芪歸健腦顆粒對(duì)Aβ25-35所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯的改善作用，其機(jī)制可能是芪歸健腦顆粒通過(guò)抑制iNOS的表達(dá)和NO的生成，減輕Aβ25-35的毒性作用。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默??；芪歸健腦顆粒；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；一氧化氮

老年性癡呆(AD)又稱(chēng)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，是發(fā)生于老年人的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行性、退行性疾病，病人主要表現(xiàn)為記憶力、判斷力以及抽象思維等功能的減退或喪失。目前其病因尚不明確，也無(wú)治療此病的特效藥。本研究采用大鼠雙側(cè)海馬注射β-淀粉樣蛋25-35 (β-amyloid protein 25-35，Aβ25-35)建立AD模型，探討芪歸健腦顆粒對(duì)老年性癡呆大鼠海馬組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induction nitricoxide synthase，iNOS)表達(dá)及一氧化氮(nitricoxide，NO)含量的影響，為臨床上老年性癡呆的防治提供理論依據(jù)，也為新藥的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠30只(由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，鼠齡(10～12)月齡，體重(368.3±12.8) g。

1.2藥品、試劑與儀器芪歸健腦顆粒由黃芪、當(dāng)歸尾、赤芍、地龍、川芎等組成，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)。Aβ25-35購(gòu)自Sigma公司，用無(wú)菌生理氯化鈉溶液將Aβ25-35稀釋成10 g/L，37℃孵育72 h，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的Aβ25-35，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩NOS兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。一氧化氮試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。腦立體定向儀：江灣Ⅰ型C，上海川沙花木農(nóng)機(jī)廠制造。

1.3動(dòng)物分組及模型將大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型組和治療組，每組10只。3組大鼠均用質(zhì)量濃度為20 g/L烏拉坦3 mL/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定向儀上。參照大鼠腦立體定位圖譜[1]，以前囟為零點(diǎn)穿刺點(diǎn)，位于前囟后3.5 mm，中線右側(cè)旁開(kāi)2 mm，用牙科鉆鉆開(kāi)顱骨，以微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針3 mm，模型組和治療組均于雙側(cè)海馬CA1區(qū)5 min內(nèi)緩慢注射Aβ25-35各1 mL(10 mg)，留針5 min，假手術(shù)組則注射等量的生理氯化鈉溶液，退針縫合傷口。術(shù)前3 d及術(shù)后18 d，治療組灌胃芪歸健腦顆粒40 mg/(kg·d)，模型組給予等量生理鹽水，假手術(shù)組大鼠正常飼養(yǎng)。末次給藥后次日用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，次日宰殺大鼠，取腦海馬組織檢測(cè)iNOS的表達(dá)水平及NO的含量。

1.4大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試(Morris 水迷宮)各組大鼠在末次給藥后次日進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。水迷宮的直徑為120 cm、高55 cm的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，水深42 cm，距池壁35 cm處放置一高40 cm，直徑8 cm圓臺(tái)。實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，實(shí)驗(yàn)前1 d讓大鼠自由游泳2 min，從第1天起，每天分上午、下午兩段，每段訓(xùn)練3次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，并開(kāi)始計(jì)時(shí)，若大鼠在120 s內(nèi)找到站臺(tái)的時(shí)間作為潛伏期；若大鼠在120 s內(nèi)未找到站臺(tái)則將其引至站臺(tái)，潛伏期記為120 s。大鼠連續(xù)訓(xùn)練4 d后，在第5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，觀察記錄其上站臺(tái)的潛伏期。

在定位航行實(shí)驗(yàn)完成后，大鼠休息3 h，撤去站臺(tái)，以同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，觀察記錄120 s內(nèi)其穿越原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)，以此作為大鼠記憶能力的檢測(cè)指標(biāo)。

1.5Western blot檢測(cè)iNOS蛋白分別取上述各組200 μg海馬組織總蛋白提取物與5×SDS上樣緩沖液混合均勻，100 ℃煮沸5 min，冰上冷卻，上樣于PAGE凝膠加樣孔內(nèi)，120 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)至凝膠底部。20 V恒壓分別50 min和120 min將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L的牛奶于37℃封閉1 h。將膜分別浸入兔抗鼠多克隆抗體iNOS(1∶300)溶液，4℃結(jié)合過(guò)夜。TTBS溶液洗膜，將膜浸入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液(1∶10 000)，37℃反應(yīng)1 h，TTBS溶液洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色。

1.6硝酸還原酶法檢測(cè)海馬組織NO的含量將大鼠斷頭開(kāi)顱取腦，在冰盤(pán)上分離出海馬，先放入液氮中，隨后放入-70℃冷凍保存。測(cè)量時(shí)，用冰生理鹽水沖洗，除去血液，濾紙拭干，稱(chēng)重，放入10 mL的小燒杯內(nèi)。先取少量預(yù)冷的生理鹽水放入小燒杯中，剪碎海馬組織塊，再加入冷生理鹽水，總量是組織塊重量的9倍，倒入勻漿管中，將小燒杯和勻漿管下端均放入冰水浴中，研磨制成10%的組織勻漿，在4℃條件下離心15 min (3 500 r/min)。取適量上清，采用硝酸還原酶法進(jìn)行NO含量測(cè)定。蛋白定量用考馬斯亮蘭法。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.7圖像處理采用美國(guó)Kodak公司數(shù)碼成像分析軟件對(duì)Western blot顯色區(qū)帶的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2結(jié)果

2.1芪歸健腦顆粒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著訓(xùn)練天數(shù)的增加，各組尋找站臺(tái)的潛伏期越來(lái)越短，表明3組大鼠通過(guò)學(xué)習(xí)，均可對(duì)水下的站臺(tái)產(chǎn)生空間定位記憶。在訓(xùn)練1 d～4 d，模型組大鼠的平均潛伏期明顯大于假手術(shù)組(P<0.05)；與模型組比較，治療組的潛伏期在訓(xùn)練2 d～ 4 d均顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，治療組大鼠穿越站臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。芪歸健腦顆粒對(duì)AD大鼠的空間記憶能力有明顯的改善作用。

表1　芪歸健腦顆粒對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響(±s)

2.2芪歸健腦顆粒對(duì)大鼠海馬iNOS表達(dá)的影響 Western blot顯示，假手術(shù)組海馬組織iNOS表達(dá)量低，模型組海馬組織表達(dá)量顯著增高(P<0.05)；給予芪歸健腦顆粒治療后，大鼠腦海馬組織iNOS表達(dá)量明顯下降，接近假手術(shù)組(P>0.05)。詳見(jiàn)圖1、表2。

圖1　Western blot檢測(cè)芪歸健腦顆粒抑制

組別niNOS假手術(shù)組100.049±0.006模型組 100.287±0.0251)治療組 100.054±0.0072) 與假手術(shù)組相比,1)P<0.05;與模型組相比,2)P<0.05。

2.3芪歸健腦顆粒對(duì)海馬組織NO含量的影響與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織NO含量均顯著升高，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療組與模型組相比，海馬組織NO含量明顯降低，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3　芪歸健腦顆粒對(duì)海馬組織NO含量的影響(±s)

3討論

學(xué)習(xí)和記憶水平體現(xiàn)了腦的高級(jí)整合功能，其功能的減退或者喪失是腦衰老的一個(gè)重要標(biāo)志。老年性癡呆的臨床癥狀主要為智力減退、近記憶缺失，以及相關(guān)行為能力障礙，因此學(xué)習(xí)和記憶水平為評(píng)價(jià)老年性癡呆的診斷和療效重要指標(biāo)。Morris水迷宮是為檢測(cè)腦的學(xué)習(xí)記憶功能而研制的，它操作簡(jiǎn)便，能較系統(tǒng)、全面地檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的空間認(rèn)知能力。本實(shí)驗(yàn)水迷宮結(jié)果顯示，模型組的定位航行潛伏期比假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明Aβ25-35具有神經(jīng)毒性，造成大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，用芪歸健腦顆粒對(duì)Aβ25-35所致AD模型大鼠治療后，學(xué)習(xí)記憶障礙得到明顯改善。

iNOS是催化產(chǎn)生內(nèi)源性NO的酶類(lèi)，NO是一種神經(jīng)遞質(zhì)，與學(xué)習(xí)和記憶有著密切關(guān)系，在神經(jīng)系統(tǒng)中具有重要的作用[2]。正常濃度的NO起著生理性的信息傳遞作用，而高濃度的NO主要表現(xiàn)為細(xì)胞毒性作用，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死。在AD大鼠腦內(nèi)，大量的Aβ能激活的小膠質(zhì)細(xì)胞從而促進(jìn)iNOS的表達(dá)，持續(xù)產(chǎn)生大量NO，還可產(chǎn)生α干擾素以增加NO的產(chǎn)量。NO除作為自由基以及與超氧陰離子結(jié)合形成超氧亞硝酸鹽(ONOO-)具有直接毒性外，還可通過(guò)激活COX-2，進(jìn)一步激活炎癥前階段，產(chǎn)生花生四烯酸的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)而參與炎癥反應(yīng)[3]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Aβ能誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)iNOS，產(chǎn)生大量NO導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[4]。在體研究進(jìn)一步表明，腦內(nèi)Aβ注射可導(dǎo)致局部膠質(zhì)細(xì)胞增生伴iNOS大量表達(dá)[5]，特異性iNOS抑制劑可完全阻斷在體條件下的NO合成[6]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，假手術(shù)組大鼠海馬組織iNOS表達(dá)很少，AD模型組大鼠海馬組織中iNOS表達(dá)水平比假手術(shù)組明顯升高，而治療組的大鼠海馬組織中iNOS表達(dá)水平比模型組顯著降低，提示AD模型組大鼠海馬組織中升高的iNOS可以使神經(jīng)細(xì)胞凋亡或壞死，發(fā)生學(xué)習(xí)記憶能力障礙或喪失；而經(jīng)芪歸健腦顆粒治療后可顯著降低AD模型大鼠海馬iNOS表達(dá)水平，改善學(xué)習(xí)記憶障礙，起到防治老年性癡呆的作用。

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(本文編輯王雅潔)

中圖分類(lèi)號(hào)：R749.1R289.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.13.012

文章編號(hào)：1672-1349(2016)13-1478-03

(收稿日期：2015-09-07)

Qigui Jiannao Granule Inhibits the iNOS Expression of and NO Content of the Hippocampus in Rats with Alzheimer Disease

Wang Yinlong，Shan Tieying

The Affiliated Hospital of Hebei University of Engineering，Handan 056002， Hebei， China

Abstract：ObjectiveTo study the effects of Qigui Jiannao granule(QJG) on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the content of nitric oxide (NO) in the hippocampus in rats with Alzheimer disease.Methods The AD model rats were established by injecting Aβ25-35 into districts of hippocampuses.The experiment was included into 3 groups：sham operation group， model group and treatment group， the ability of learning and memory was detected by Morris water maze.The protein expression levels of iNOS in the hippocampus of each group rats were detected by western blot.NO content of hippocampal tissues was detected by nitrate reductase method.Results The latency of model group rats was lengthened， the frequency of passing through platform was decreased， the expression level of iNOS was increased；the differences were statistically significant compared with sham operation group (P<0.05).Qiguijiannao granule could obviously shorten the latency of AD rats and increase the frequency of passing through platform.It decreased the expression level of iNOS and content of NO， the differences were statistically significant compared with sham operation group (P<0.05).ConclusionsQiguijiannao granule has a protective effect on learning and memory of AD rats.Its mechanism may be that extract of astragalus can reduce Aβ25-35 toxic effect by inhibiting the expression level of of iNOS and content of NO.

Key words：Alzheimer disease；Qigui Jiannao granule；inducible nitric oxide synthase；nitric oxide

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