李衍方, 高彩霞， 韓相恩

(1. 中國礦業(yè)大學 化工學院，江蘇 徐州 221116； 2. 徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221000； 3. 北京海德潤制藥有限公司，北京 101113)

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大孔樹脂純化欒樹葉多酚工藝研究

李衍方1,2, 高彩霞3， 韓相恩1*

(1. 中國礦業(yè)大學 化工學院，江蘇 徐州 221116； 2. 徐州市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，江蘇 徐州 221000； 3. 北京海德潤制藥有限公司，北京 101113)

摘要：以欒樹葉多酚提取物為原料，比較了7種大孔樹脂對欒樹葉多酚的靜態(tài)吸附與解吸效果，結(jié)果表明AB-8樹脂性能最佳，其24 h靜態(tài)吸附量為13.74 mg/g,解吸率為98.35 %， 3 h內(nèi)達到吸附平衡與解吸平衡。AB-8樹脂動態(tài)吸附較佳條件為上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L，上樣液pH值為6，在此條件下吸附率為88.21 %，動態(tài)洗脫較佳條件為洗脫劑乙醇體積分數(shù)為60 %，洗脫速度為1 mL/min，解吸率達到89.91 %，在該條件下欒樹葉總多酚經(jīng)AB-8樹脂純化后，質(zhì)量分數(shù)由50.36 %增加到72.37 %，回收率為86.83 %。

關(guān)鍵詞：欒樹葉多酚；純化；大孔樹脂

欒樹(KoelreuteriapaniculataLaxm.)，無患子科(Sapindaceae)欒樹屬(Koelreuteria)植物，落葉灌木或喬木。欒樹屬共有4種、 1變種，中國產(chǎn)3種、 1變種，另1種產(chǎn)于大洋洲斐濟群島。該屬植物在我國資源豐富，藥用價值高，漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》記載欒華(花)“主目痛，淚出傷眥，消目腫”；唐代《唐本草》記載“合黃連共煎，療目赤”，我國民間以搖錢樹的花和根做“疏風清熱、止咳殺蟲”藥，欒樹所含成分的生物活性主要有抑菌[1]、細胞毒性和抗癌[2]、抗氧化[3-4]、殺蟲[5]等。欒樹葉含有大量多酚物質(zhì)，主要組分為山奈酚及其衍生物、沒食子酸及其衍生物、β-谷甾醇及其衍生物、金絲桃苷及槲皮苷等[6-7]。大孔樹脂具有吸附快、吸附量大、穩(wěn)定性好、選擇性高、易解吸、易再生等諸多優(yōu)點，近年來被廣泛用于多酚類物質(zhì)的分離與富集[8-9]。本研究選取了7種對多酚分離純化效果較好的樹脂，從中篩選出一種性能較佳樹脂，考察該樹脂對欒樹葉多酚的靜態(tài)、動態(tài)吸附與解吸性能及主要影響因素，從而確定欒樹葉多酚的較佳純化方法。

1實 驗

1.1材料與試劑

欒樹(KoelreuteriapaniculataLaxm.)葉多酚提取物按文獻[10]自制。具體制備過程如下：稱取一定質(zhì)量粉碎后的欒樹葉粉末，以液料比25∶1 (mL∶g)加入72 %乙醇水溶液，超聲波功率200 W，提取溫度60 ℃，超聲波提取時間為每次15 min，提取3次，過濾，合并濾液，濾液于45 ℃減壓濃縮至30 mL，加水至200 mL，先以石油醚萃取3次，每次60 mL，再以乙酸乙酯萃取3次，每次60 mL，合并乙酸乙酯萃取液，45 ℃下減壓濃縮至干，得欒樹葉多酚提取物。

大孔樹脂AB-8、D101、HPD100、HPD400、HPD500、HPD600、HPD750，滄州寶恩化工有限公司。沒食子酸對照品(110831-201204)，中國食品藥品檢定研究院；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；蒸餾水，自制。

1.2儀器

KQ-200KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Lambda 25紫外可見分光光度計，珀金埃爾默儀器(上海)有限公司；玻璃層析柱(Φ2 cm×30 cm)，泰興市三愛思實驗儀器廠。

1.3總多酚測定

1.3.1標準曲線的繪制參考文獻[10]進行繪制，線性回歸方程Y=0.132 99+0.063 39，R=0.999 26，線性范圍為1～10 mg/L。

1.3.2樣品中總多酚質(zhì)量分數(shù)的測定精確稱取0.020 0 g待測樣品，少量無水乙醇溶解后，加入蒸餾水定容至100 mL，得到0.2 g/L樣品溶液，取1 mL樣品溶液至10 mL容量瓶中，加入1 mL蒸餾水，搖勻，加入1 mL福林酚試劑，搖勻，靜置4 min后，加入2 mL飽和Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，25 ℃下避光放置2 h，于750 nm處重復(fù)測定3次吸光值，取平均值，代入1.3.1節(jié)的回歸方程，計算樣品溶液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(1)計算欒樹葉多酚提取物中多酚質(zhì)量分數(shù)：

w=C×V/(n×m)×100 %

(1)

式中：w—多酚質(zhì)量分數(shù)，%； C—多酚質(zhì)量濃度，mg/L； V—樣品體積，mL； n—稀釋倍數(shù)，10； m—樣品質(zhì)量，g。

通過計算得到提取物中多酚的質(zhì)量分數(shù)為50.36 %。

1.4大孔樹脂的預(yù)處理

將大孔樹脂于95 %乙醇中浸泡24 h，不斷攪拌，除去氣泡，用蒸餾水洗至無乙醇味，然后用5 %HCl溶液浸泡3 h，再用蒸餾水洗至中性，最后用5 % NaOH溶液浸泡3 h，用蒸餾水洗至中性。

1.5大孔樹脂的靜態(tài)吸附和解吸實驗

1.5.1靜態(tài)吸附以80 %乙醇水溶液為溶劑，配制一系列質(zhì)量濃度的欒樹葉多酚提取物。稱取經(jīng)預(yù)處理的7種型號的大孔樹脂各2 g，用濾紙吸干表面水分后，置于150 mL具塞磨口三角瓶中，加入一定質(zhì)量濃度的欒樹葉多酚提取物80 %乙醇溶液40 mL，置于搖床上， 25 ℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h，取上清液測定溶液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(2)和(3)計算吸附量和吸附率：

Q=(C0-C1)×V/m

(2)

A=(C0-C1)/C0×100 %

(3)

式中：Q—樹脂吸附量，mg/g；A—樹脂吸附率，%； C0—起始溶液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；C1—上清液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；V—溶液體積，mL；m—樹脂質(zhì)量，g。

1.5.2靜態(tài)解吸將充分吸附后的樹脂用蒸餾水快速洗至大孔樹脂表面無多酚溶液殘留，加入體積分數(shù)80 %乙醇水溶液40 mL于各吸附完全的樹脂中，置于搖床上， 25 ℃下，以轉(zhuǎn)速120 r/min振蕩24 h，取上清液測定洗脫液中總多酚質(zhì)量濃度，按照式(4)計算解吸率：

D=(Cd×Vd)/(m×Q)×100 %

(4)

式中：D—樹脂解吸率，%；Cd—解吸后溶液中總多酚質(zhì)量濃度，g/L；Vd—解吸液體積，mL。

1.5.3AB-8樹脂靜態(tài)吸附與解吸動力學曲線的繪制比較了7種大孔樹脂對欒樹葉多酚的靜態(tài)吸附和解吸性能，最終選取了吸附和解吸性能均較好的AB-8大孔樹脂進行靜態(tài)吸附動力學特性的研究。

稱取3份經(jīng)預(yù)處理好的AB-8樹脂2 g，多酚質(zhì)量濃度2.85 g/L的欒樹葉多酚提取物80 %乙醇溶液40 mL，按1.5.1節(jié)操作靜態(tài)吸附12 h，每隔0.5 h取0.1 mL溶液測定總多酚質(zhì)量濃度，計算吸附率，繪制吸附動力學曲線。

按1.5.2節(jié)的操作將充分吸附的樹脂解吸12 h，每隔0.5 h取0.1 mL溶液測定總多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率，繪制靜態(tài)解吸動力學曲線。

1.6AB-8樹脂對欒樹葉多酚純化條件的確定

1.6.1上樣液質(zhì)量濃度對樹脂吸附率的影響將預(yù)處理好的樹脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹脂填充高度為20 cm，將欒樹葉多酚提取物溶液配置成6個不同質(zhì)量濃度的上樣液，分別為2、 3、 4、 5、 6和8 g/L，上樣體積分別為8.0、 5.3、 4.0、 3.2、 2.7和2.0 mL，上樣速度為2 mL/min，上樣液pH值為6，分別上樣，吸附2 h后測定吸附后溶液中多酚質(zhì)量濃度，計算吸附量。

1.6.2上樣液pH值對樹脂吸附率的影響將預(yù)處理好的樹脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹脂填充高度為20 cm，將質(zhì)量濃度為4 g/L欒樹葉多酚提取物溶液分成5份，分別調(diào)節(jié)其pH值為2、 4、 6、 8、 10后上樣，上樣液體積4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，測定吸附后溶液中多酚質(zhì)量濃度，計算吸附量。

1.6.3洗脫劑體積分數(shù)對樹脂解吸率的影響將預(yù)處理好的樹脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹脂填充高度為20 cm，加入4 g/L欒樹葉多酚提取物溶液4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分數(shù)分別為40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %乙醇溶液作為洗脫劑進行洗脫，洗脫流速為1 mL/min，每5 mL收集1管，共收集24管，測定每管洗脫液中多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

1.6.4洗脫劑流速對樹脂解吸率的影響將預(yù)處理好的樹脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹脂填充高度為20 cm，加入質(zhì)量濃度為4 g/L欒樹葉多酚提取物溶液4 mL，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分數(shù)為60 %乙醇溶液作為洗脫劑進行洗脫，洗脫流速分別為0.5、 1、 2、 3 mL/min，每5 mL收集1管，共收集24管，測定每管洗脫液多酚質(zhì)量濃度，計算解吸率。

1.7動態(tài)洗脫曲線及多酚純度

將預(yù)處理好的樹脂20 g裝入玻璃層析柱中(30 cm×2 cm)，樹脂填充高度為20 cm，加入質(zhì)量濃度為4 g/L的欒樹葉多酚提取物溶液，上樣速度2 mL/min，吸附2 h后，用體積分數(shù)為60 %乙醇溶液洗脫，洗脫流速為1 mL/min，同時于柱末端收集流出液，每5 mL收集1管，共收集24管，測定每管中總多酚的質(zhì)量濃度，繪制動態(tài)洗脫曲線，收集洗脫液，于50 ℃下減壓濃縮至干，得濃縮物，稱質(zhì)量，按1.3.2節(jié)計算濃縮物中多酚質(zhì)量分數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1大孔樹脂的篩選

2.1.1不同樹脂吸附與解吸附能力的比較大孔樹脂吸附能力的大小與樹脂的極性、比表面積、孔徑、能否與吸附物形成氫鍵等因素有關(guān)，對7種大孔樹脂進行吸附和解吸附實驗，結(jié)果見表1。由表1可知：HPD500樹脂吸附率最高為89.01 %，其次是HPD400樹脂吸附率為88.95 %，雖然AB-8樹脂吸附率略低于HPD500及HPD400，但其解吸率最高為98.35 %。綜合考慮吸附和解吸附效果，選擇AB-8樹脂進行后續(xù)的純化工作。

表 1　不同大孔樹脂對欒樹葉多酚的吸附和解吸性能

2.1.2AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附與解吸曲線圖1給出了AB-8樹脂的吸附與解吸曲線。由圖1可知:AB-8樹脂在3 h基本達到飽和，再延長吸附時間，吸附率變化不大，屬于快速平衡型。樹脂在3 h內(nèi)基本完全解吸，解吸率達到98.29 %。

圖 1　AB-8樹脂的吸附(a)與解吸(b)曲線Fig. 1　Adsorption (a) and desorption (b) curves of AB-8

2.2AB-8樹脂對欒樹葉多酚的純化條件

2.2.1上樣液質(zhì)量濃度由圖2可知：當多酚質(zhì)量濃度在2～4 g/L時，樹脂吸附率隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而迅速增加，當多酚質(zhì)量濃度在4～8 g/L時，樹脂吸附率隨著多酚質(zhì)量濃度的增加而降低。上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L時，吸附率達到最大，為87.45 %。這是因為當樣液質(zhì)量濃度較低時，AB-8樹脂的吸附量隨著樣液質(zhì)量濃度的增加而增加，但是，當樣液質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，與多酚競爭吸附的雜質(zhì)也在增加，導(dǎo)致樹脂吸附量有所下降。因此選擇上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L。

2.2.2上樣液pH值由圖3可知：上樣液pH值較小，酸性較強時，樹脂吸附率較小，上樣液pH值為6時，樹脂吸附率最大，為88.21 %，上樣液堿性增大時，樹脂吸附率降低明顯。這可能是由于欒樹葉中多酚大多屬于黃酮類物質(zhì)，含酚羥基較多，呈弱酸性，故在弱酸性條件下吸附效果好。因此選擇上樣液較佳pH值為6。

圖 2　上樣液質(zhì)量濃度對樹脂吸附率的影響　　　　　　　圖 3　上樣液pH值對樹脂吸附率的影響Fig. 2　Effect of sample mass concentration on absorption　　Fig. 3　Effect of sample pH value on absorption

2.2.3洗脫劑體積分數(shù)由圖4可知：隨著乙醇體積分數(shù)的增大，多酚解吸率呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢，當乙醇體積分數(shù)為60 %時，解吸率達到最大值，為88.89 %。這可能是由于乙醇極性比水弱，故體積分數(shù)大的乙醇能溶解出更多的弱極性物質(zhì)，同時，更多的雜質(zhì)也被溶解出來。因此選用60 %乙醇為柱層析純化用洗脫劑。

2.2.4洗脫劑流速由圖5可知：洗脫劑流速低于1 mL/min時，多酚類化合物的死吸附過多，解吸率低；洗脫劑流速高于1 mL/min時，洗脫劑沒來得及與吸附在樹脂上的多酚充分接觸，使其不能將多酚完全置換出來，致使多酚類化合物解吸率降低明顯。因此較佳洗脫速率為1 mL/min，解吸率為89.91 %。

2.3動態(tài)洗脫曲線及多酚含量

由圖6可知：開始時，洗脫液中多酚質(zhì)量濃度隨著洗脫體積的增加而增大，當洗脫至第9管時，多酚質(zhì)量濃度增加顯著，第12管時洗脫液中多酚質(zhì)量濃度達到最大值，之后隨著洗脫體積的增加，多酚質(zhì)量濃度逐漸下降，第16管后多酚質(zhì)量濃度下降明顯，因此收集9～16管的40 mL洗脫液，于50 ℃下減壓濃縮至干，稱質(zhì)量，得濃縮物，測定濃縮物中多酚質(zhì)量分數(shù)為72.37 %，回收率為86.83 %。

圖 4洗脫劑濃度對多酚解吸率的影響

圖 5洗脫劑流速對多酚解吸率的影響

圖 6欒樹葉多酚動態(tài)洗脫曲線

Fig. 4Effect of ethanol concentration on desorption rate

Fig. 5Effect of elution speed on desorption rate

Fig. 6Dynamic desorption curve of polyphenols ofK.paniculata

3結(jié) 論

3.1以欒樹葉多酚提取物為原料，研究了7種大孔樹脂對欒樹葉多酚的靜態(tài)吸附與解吸附效果，從7種大孔樹脂中篩選出最為適宜的AB-8樹脂，其24 h靜態(tài)吸附量為13.74 mg/g，解吸率為98.35 %。

3.2以欒樹葉多酚提取物為原料，通過動態(tài)吸附與解吸研究，確定AB-8樹脂動態(tài)吸附較佳條件為上樣液質(zhì)量濃度為4 g/L，上樣液pH值為6，此時，吸附率為88.21 %。AB-8樹脂動態(tài)洗脫較佳條件為洗脫劑乙醇體積分數(shù)為60 %，洗脫速度為1 mL/min，解吸率為89.91 %。

3.3按照以上較佳柱層析條件純化欒樹葉多酚提取物，總多酚質(zhì)量分數(shù)由50.36 %增加到72.37 %，回收率為86.83 %。

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doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2016.04.008

收稿日期：2015-12-29

基金項目:中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金(2015XKZD08)

作者簡介：李衍方(1982— )，女，江蘇徐州人，工程師，博士生，主要從事天然資源化學利用工作 *通訊作者：韓相恩，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究領(lǐng)域：天然資源化學利用;E-mail:xiangenh@163.com。

中圖分類號：TQ35；Q946.82

文獻標識碼：A

文章編號：1673-5854(2016)04-0042-05

Purification of Polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. Leaves by Macroporous Resin

LI Yan-fang1,2, GAO Cai-xia3, HAN Xiang-en1

(1. China University of Mining and Technology,School of Chemical Engineering and Technology, Xuzhou 221116, China;2. Xuzhou Products Quality Supervision and Inspection Center, Xuzhou 221000, China; 3. Beijing Haiderun Pharmaceutical Co. Ltd, Beijing 101113, China)

Abstract:The absorption and desorption behaviors of seven macroporous resins for polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. were investigated. The 24 h static adsorption capacity and desorption rate of AB-8 resin was 13.74 mg/g and 98.35 %,respectively. The static adsorption and desorption equilibrium time of AB-8 resin was both less than 3 h. The optimum conditions of dynamic absorption and desorption by AB-8 were sample mass concentration 4 g/L,sample pH value 6,and volume fraction of ethanol 60 %,elution speed 1 mL/min,respectively.Under these conditions,the adsorption rate was 88.21 % and desorption rate was 89.91 %.The purity of polyphenols from Koelreuteria paniculata Laxm. increased from 50.36 % to 72.37 % after purification using AB-8 resin and the recovery rate was 86.83 %.

Key words:polyphenols of Koelreuteria paniculata Laxm. leaves;purification;macroporous resin

·研究報告——生物質(zhì)天然活性成分·