楊淑娟, 游艷芝, 卜令習, 李曉利, 蔣建新*

(1. 北京林業(yè)大學 材料科學與技術學院；林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程中心，北京 100083;2. 國網(wǎng)節(jié)能服務有限公司 北京生物質(zhì)能源技術中心，北京 100053)

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廢紙脫墨漿預處理及其酶解性能研究

楊淑娟1, 游艷芝1, 卜令習2, 李曉利1, 蔣建新1*

(1. 北京林業(yè)大學 材料科學與技術學院；林業(yè)生物質(zhì)材料與能源教育部工程中心，北京 100083;2. 國網(wǎng)節(jié)能服務有限公司 北京生物質(zhì)能源技術中心，北京 100053)

摘要：以預處理后的廢紙脫墨漿為底物，纖維素酶和纖維二糖酶為水解酶，研究了不同預處理方法(包括Na2SO3、H2O2、HCl)對酶解得率的影響。結(jié)果表明：與原料相比， 3種預處理方法都不同程度地提高了纖維素含量，增加底物的比表面積，降低纖維素的結(jié)晶度，促進酶水解；其中， H2O2預處理后的廢紙脫墨漿的酶解得率最高，為91.67 %，其次是亞硫酸鈉預處理和鹽酸預處理，得率分別為87.57 %和82.49 %。

關鍵詞：廢紙脫墨漿；預處理；酶水解；表面積；結(jié)晶度

為緩解全球環(huán)境污染及能源損耗問題，將一些廢棄的生物質(zhì)通過預處理、酶解糖化、微生物發(fā)酵等過程轉(zhuǎn)化為能源及化學品具有重要的意義。其中，對廢紙進行脫墨制漿后，所得廢紙脫墨漿可以作為一種富含纖維素的生物質(zhì)原料，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化制備生物基燃料和化學品。由于廢紙的組成比較復雜，不僅包括纖維素組分，還存在著紙漿中殘余的木質(zhì)素和半纖維素包圍在纖維素微細纖維周圍，對纖維素酶降解碳水化合物產(chǎn)生空間阻礙作用,影響纖維素的水解，降低纖維原料的酶解效率[1-3]。此外,纖維素的高結(jié)晶度也是導致其難以利用的重要因素。因此，為了使廢紙脫墨漿酶解應用在經(jīng)濟上可行，為后續(xù)發(fā)酵提供足夠碳源，降低生物質(zhì)產(chǎn)品(乙醇、丁醇等液體燃料)的生產(chǎn)成本[4]，必須降低酶用量，獲得高酶解得率，這就需要在纖維素酶解之前，對原料進行相應的預處理，除去部分半纖維素和木質(zhì)素，增加纖維素的可及性。本研究探討了廢紙脫墨漿經(jīng)過HCl、 Na2SO3和H2O2這3種方法預處理后，紙漿組分、比表面積和結(jié)晶度的變化以及對葡萄糖得率的影響。

1實 驗

1.1材料與儀器

廢紙脫墨漿，華泰造紙廠提供；纖維素酶(Celluclast,1.5 L，74 FPU/mL)和纖維二糖酶(Novozyme188，175 CBU/mL)，購于Sigma公司；HCl、Na2SO3以及H2O2，AR，國藥集團。

Waters 2695e液相色譜儀，Waters 公司；XRD-6000 X射線衍射儀，日本Shimadzu；Tristar 3020Ⅱ 比表面積測定儀，美國Micromeritics。

1.2廢紙脫墨漿的預處理

1.2.1Na2SO3預處理10 g(絕干)廢紙脫墨漿加入到聚四氟乙烯制作的預處理反應器中，加入0.75 g NaOH和2 g Na2SO3，加入一定量的去離子水至100 mL混合均勻后密封，然后將預處理反應器轉(zhuǎn)入不銹鋼罐，并保持固定；均相反應器以5 ℃/min的升溫速率達到140 ℃；2 h后，迅速用自來水將系統(tǒng)冷卻；用去離子水將不溶性殘渣洗滌至中性，并在105 ℃下烘箱中烘干至質(zhì)量恒定。

1.2.2HCl預處理10 g(絕干)廢紙脫墨漿,按固液比1∶10(g∶mL)的比例加入2 % HCl溶液潤浸，于室溫(30 ℃左右)，攪拌反應2 h；用去離子水將紙漿洗凈，并在105 ℃下烘箱中烘干至質(zhì)量恒定。

1.2.3H2O2預處理H2O2預處理參照紙漿漂白工藝[5]，取10 g(絕干)廢紙脫墨漿置于燒杯中，加入100 mL去離子水，依次加入2 % H2O2、 1 % NaOH、 2 % Na2SO3、 0.05 % MgSO4和0.15 % EDTA， 70℃下攪拌反應1.5 h；用去離子水將紙漿洗凈，并在105℃下烘箱中烘干至質(zhì)量恒定。

1.3預處理后廢紙脫墨漿的酶解

原料和預處理后的紙漿進行纖維素酶水解實驗。分別稱取3 g(絕干)廢紙脫墨漿作底物于錐形瓶中，依次加入纖維素酶18 FPU/g(以纖維素質(zhì)量計，下同)、纖維二糖酶27 CBU/g，最后加入pH值4.8的醋酸-醋酸鈉緩沖液至60 mL配成底物質(zhì)量濃度0.05 g/L；將密封的錐形瓶置于48 ℃下的振動培養(yǎng)箱中以150 r/min反應96 h。在0、12、24、36、48、72、96 h處取樣(2 mL)，先將樣品在3 000 r/min的離心機中離心3 min，用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液[6-7]，然后采用HPLC法測定各單糖濃度，計算酶解得率。

1.4分析及表征

1.4.1預處理前后廢紙脫墨漿的組分分析按照美國可再生能源實驗室的方法分析廢紙脫墨漿中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和灰分的含量[8]。 反應結(jié)束后，向水解液中加入84 mL去離子水將硫酸稀釋到體積分數(shù)3 %。擰緊耐壓瓶蓋，然后將其置于121 ℃的高壓滅菌鍋中反應1 h。反應結(jié)束后，冷卻至室溫，取上清液通過HPLC測定樣品中的糖類組分。用G3坩堝過濾得到的殘渣為Klason木質(zhì)素以及樣品中的灰分，在105 ℃烘箱中烘干，測得其質(zhì)量。最后將含有固體殘渣的G3坩堝置于600 ℃馬弗爐中煅燒6 h，冷卻，稱量，測定其中灰分含量。樣品中的木質(zhì)素含量為除去灰分后的固體質(zhì)量[9]。

1.4.2底物表征(BET)采用氮氣吸附BET原理測定不同預處理后紙漿的比表面積，由于廢紙脫墨漿纖維素不易分離，所以測定前需要對其進行相應處理。取一定量紙漿于燒杯中，加入去離子水，用攪拌器將其分散，待完全分散后，加入丙酮，繼續(xù)用攪拌器攪拌1 h，過濾，如此重復3次；將濾凈的纖維撕成小片，放入恒溫鼓風干燥箱中， 60 ℃下干燥8 h，脫掉水分和丙酮；利用疏解器分離纖維素，即可得到單根纖維間相互分離的纖維。用以上處理過的纖維進行氮氣吸附測定比表面積，根據(jù)BET方程式，測出被測樣品單分子層的吸附量，從而計算樣品的比表面積。

1.4.3X射線衍射(XRD)Cu靶，石墨單色器，加速電壓30 kV，電流20 mA，掃描步長0.5 °，掃描速度0.2 (°)/min，掃描范圍(2θ)為5 °～60 °[10]。木質(zhì)纖維物料的相對結(jié)晶度ICr(%)通過以下公式計算：

ICr=(I002-Iam)/I002×100 %

式中：I002—校正后結(jié)晶區(qū)強度， 2θ=22.5 °；Iam—校正后無定形區(qū)強度， 2θ=16.6 °。

2結(jié)果與討論

2.1預處理對廢紙脫墨漿組成、形貌及結(jié)晶度的影響

表 1　預處理對廢紙脫墨漿主要組成的影響

2.1.2形貌研究發(fā)現(xiàn)，影響酶水解的因素有多種，包括木質(zhì)素含量、比表面積、聚合度等，它們之間相互作用共同影響纖維素的可及性，其中，底物的比表面積對纖維素可及度起到關鍵作用，孔徑以及孔容也會不同程度影響纖維素的可及度[10,12]。表2給出了原料及不同預處理后紙漿的比表面積、孔徑和孔容。從表2可以看出，預處理后，廢紙脫墨漿比表面積、孔徑以及孔容均有所增加。其中Na2SO3處理的物料比表面積、孔容最大，孔徑也有明顯的增加。Na2SO3處理，脫除大量木質(zhì)素，并伴隨著部分半纖維素溶出，暴露出更多的纖維素，增加其比表面積，提高纖維素的可及度，促進酶水解[9]。HCl在低溫下主要是通過部分水解半纖維素和木質(zhì)素，使纖維表面膨脹和松動，增加其孔隙度。H2O2處理后，通過氧化降解木質(zhì)素來打破網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而提高纖維素的可及度,增加纖維素與酶的接觸面積,提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率。

表 2　不同預處理對底物比表面積、孔徑、孔容的影響

2.1.3結(jié)晶度纖維素大分子是由D-吡喃式葡萄糖基以β-1,4苷鍵連接起來的鏈狀高分子化合物，其大量羥基的存在使纖維素分子內(nèi)和分子間存在著大量的氫鍵。氫鍵作用強的地方排列得比較整齊有規(guī)則，形成結(jié)晶區(qū)，氫鍵作用弱的地方是纖維素的無定形區(qū)[13]。纖維素酶首先作用于無定形區(qū)，水解速度快，然后再降解結(jié)晶區(qū)弱的區(qū)域，水解速度較慢。在此過程中，分子間的氫鍵網(wǎng)絡的存在起關鍵作用。通過XRD可以測定纖維素的結(jié)晶度，從而探討預處理對纖維素結(jié)構(gòu)的影響。原漿及3種預處理后樣品的XRD圖譜如圖1所示，原料與預處理樣品的最強衍射峰均在22.5 °和16.3 °，為典型的纖維素圖譜。經(jīng)計算，原料以及Na2SO3、HCl和H2O2預處理的紙漿的結(jié)晶度分別為48.8 %、42.0 %、43.0 %和45.6 %。可以看出，經(jīng)過3種預處理后，不僅可以去除部分半纖維素和木質(zhì)素，同時可有效作用于纖維素的結(jié)晶區(qū)部分，使得無定形區(qū)相對增加，增大了纖維素的可及度，促進酶水解，提高葡萄糖得率。Na2SO3預處理過程中，加入的NaOH形成堿溶液，很容易進入纖維素分子之間，消除分子間的作用力，潤脹原料，從而增加其內(nèi)部表面積，降低結(jié)晶度[14]。利用HCl處理廢紙脫墨漿，纖維素大分子的苷鍵對酸的穩(wěn)定性很低，在溫和條件下，發(fā)生水解降解，促使氫鍵斷裂，擴大無定形區(qū)，效果僅次于Na2SO3預處理。同時水解半纖維素，疏松原料結(jié)構(gòu)，使得纖維素酶可以更好的與纖維素接觸，提高水解效率[15]。H2O2預處理過程中，部分纖維素受到氧化，促使氫鍵被氧化[16]，在堿性溶液中斷裂，降低結(jié)晶度。但是由于H2O2主要與木質(zhì)素作用，所以其效果稍遜于Na2SO3和HCl預處理。

2.2預處理對酶解得率的影響

3種不同預處理方式的廢紙脫墨漿的酶水解葡萄糖得率隨著水解時間逐漸增加，如圖2所示。纖維素酶加入量18 FPU/g，纖維二糖酶加入量27 CBU/g，水解96 h后，經(jīng)H2O2處理后的廢紙脫墨漿葡萄糖得率最高，為91.67 %，其次是Na2SO3、HCl預處理后的紙漿，得率分別為87.57 %、82.49 %，與原漿(77.50 %)相比，均有所提高。這是因為經(jīng)過H2O2處理，部分木質(zhì)素的脫除，抑制了木質(zhì)素對酶的無效吸附作用，從而提高液體中游離酶量以及纖維素的可及性。同時，預處理后增加了底物的比表面積，降低纖維素的結(jié)晶度，這些都有利于提高酶水解效率，另外，在H2O2預處理過程中加入了少量的EDTA，抑制了金屬離子對酶活的抑制作用[17]，使酶水解得到改善，雙重促進作用使得H2O2預處理后葡萄糖得率最高。Na2SO3預處理是在堿性環(huán)境中進行的，預處理過程中有木質(zhì)素磺酸鹽生成，有研究報道木質(zhì)素磺酸鹽對酶水解過程具有促進作用[18]，并且比表面積的擴大和結(jié)晶度的降低都有利于促進酶水解。而HCl預處理，H+濃度較低時作用于纖維素結(jié)構(gòu)較松散的無定形區(qū)并導致纖維素分子鏈發(fā)生斷裂,同時促進半纖維素的降解溶出[19]，更多的纖維素被暴露，從而增加了纖維素酶與纖維素接觸的幾率,促進了酶解作用,由此提高葡萄糖產(chǎn)量。

圖 1不同預處理底物與原料的X射線衍射圖

圖 2不同預處理底物與原料葡萄糖得率

Fig. 1X-ray diffraction of deinking waste paper pulp with different pretreatments

Fig. 2Glucose yield of deinking waste paper pulp with different pretreatments

3結(jié) 論

3.1分別利用HCl、Na2SO3、H2O2對廢紙脫墨漿進行預處理，對預處理前后漿的組成、結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果表明：經(jīng)H2O2預處理后的紙漿中纖維素最高，達到61.60 %；Na2SO3預處理后纖維素的比表面積最大，為2.533 m2/g； 3種預處理漿的纖維結(jié)晶度均有所降低，其中Na2SO3和HCl效果最明顯，分別為42.0 %和43.0 %。

3.2分別以3種預處理漿為水解底物，進行酶解產(chǎn)葡萄糖研究。結(jié)果表明：在底物質(zhì)量濃度0.05 g/L，纖維素酶用量18 FPU/g(以纖維素計，下同)，纖維二糖酶用量27 CBU/g， 48 ℃的條件下酶水解96 h后，經(jīng)H2O2預處理紙漿葡萄糖得率最高為91.67 %，相比原漿(77.50 %)提高了14.17個百分點，其次是Na2SO3處理(87.57 %)和 HCl預處理(82.49 %)。

參考文獻：

[1]宋群立. 農(nóng)業(yè)秸稈類生物質(zhì)制取生物燃料的研究進展[J]. 廣州化工,2014，42(5)：36-38.

[2]董錫文. 纖維素廢棄物發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸[D]. 濟南:山東大學碩士學位論文，2005.

[3]周振. 木聚糖酶強化纖維素酶對植物纖維的水解[D]. 南京:南京林業(yè)大學碩士學位論文，2008.

[4]YU Zhi-sheng,ZHANG Hong-xun. Ethanol fermentation of acid-hydrolyzed cellulosic pyrolysate withSaccharomycescerevisiae[J]. Bioresource Technology,2004,93(2):95-100.

[5]詹懷宇. 制將原理與工程[M]. 3版.北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.

[6]于海龍. 綠液預處理工業(yè)纖維渣酶水解過程及其機理研究[D]. 北京:北京林業(yè)大學博士學位論文,2015.

[7]XING Yang,YU Hai-long,Zhu Li-wei,et al. Efficient enzymaic hydrolysis of bamboo by pretreatment with steam explosion and alkaline peroxide [J]. Bioresources,2013,8(4):5392-5408.

[8]SLUITER A,HAMES B,RUIZ R,et al. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass, NREL/TP-510-42618[R]. Golden:U.S. Department of Energy Office of Energy and Renewable Energy,2008.

[9]YU Hai-long,XING Yang,LEI Fu-hou,et al. Improvement of the enzymatic hydrolysis of furfural residues by pretreatment with combined green liquor and ethanol organosolv[J]. Bioresource Technology,2014,167:46-52.

[10]ZHANG Qi,ZHANG Peng-fei,WANG Dong-hai,et al. Relationships between cellulosic biomass particle size and enzymatic hydrolysis sugar yield: Analysis of inconsistent reports in the literature[J]. Renewable Energy,2013,60(4):127-136.

[11]ZHANG Chao,ZHUANG Xin-shu,WANG Zhao-jiang,et al. Xylanase supplementation on enzymatic saccharification of dilute acid pretreated poplars at different severities[J]. Cellulose,2013,20(4):1937-1946.

[12]WIMAN M,DIENES D,MADS A,et al. Cellulose accessibility determines the rate of enzymatic hydrolysis of steam-pretreated spruce[J]. Bioresource Technology,2012,126:208-215.

[13]YANG Hai-ping,YAN Rong,CHENG Han-ping,et al. Characteristics of hemicellulose,cellulose and lignin pyrolysis[J]. Fuel,2007,86(12/13):1781-1788.

[14]王永忠，冉堯，陳蓉,等. 不同預處理方法對稻草秸稈固態(tài)酶解特性的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報,2013(1):225-231.

[15]羅鵬,劉忠. 用木質(zhì)纖維原料生產(chǎn)乙醇的預處理工藝[J]. 釀酒科技,2005(8):42-47.

[16]楊淑蕙. 植物纖維化學[M]. 3版.北京：中國輕工業(yè)出版社,2006.

[17]李德瑩,龔大春,田毅紅,等. 金屬離子對纖維素酶活力影響的研究[J]. 釀酒科技,2009(6):40-42.

[18]賴煥然. 長鏈脂肪醇和木質(zhì)素磺酸鹽對纖維素酶解的強化作用及其應用[D]. 廣州:華南理工大學碩士學位論文,2014.

[19]陳尚钘,勇強，徐勇,等. 稀酸預處理對玉米秸稈纖維組分及結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國糧油學報,2011,26(6):13-19.

doi:10.3969/j.issn.1673-5854.2016.04.007

收稿日期：2016-03-01

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31070510);科技部國際科技合作專項(2014DFG32550)

作者簡介：楊淑娟(1991— )，女，山東臨沂人，碩士生，主要從事廢紙再利用研究工作 *通訊作者：蔣建新，教授，博士生導師，主要從事林產(chǎn)化工及生物質(zhì)能源方面的研究；E-mail：jiangjx@bjfu.edu.cn。

中圖分類號：TQ352

文獻標識碼：A

文章編號：1673-5854(2016)04-0037-05

Pretreatment of Waste Paper Pulp and Enzymatic Hydrolysis Properties

YANG Shu-juan1, YOU Yan-zhi1, BU Ling-xi2, LI Xiao-li1, JIANG Jian-xin1

(1. College of Material Science and Technology,MOE Engineering Research Center of Forestry Biomass Materials and Bioenergy,Beijing Forestry University, Beijing 100083, China; 2. Beijing Biomass Energy Technology Center,State Grid Energy Conservation Service Ltd., Beijing 100053, China)

Abstract:In order to study the effects of various pretreatments(Na2SO3,H2O2 and HCl) on enzymatic hydrolysis of deinking waste paper pulp,the hydrolyses were carried out with the pretreated pulp as substrate and cellulase and cellobiase as hydrolytic enzyme.It was concluded that three pretreatment methods could increase glucose yield by improving the content of cellulose,inceasing the specific area and disrupting its structure.Compared with the yield of raw pulp,the highest yield was achieved with the hydrolysis of hydrogen peroxide pretreated deinking waste paper pulp (91.67 %),closely followed by sodium sulfite (87.57 %) and dilute acid pretreatment (82.49 %).

Key words:deinking waste paper pulp;pretreatment;enzymatic hydrolysis;surface area;crystallinity

·研究報告——生物質(zhì)材料·