王云霞　張　鑫

西安市食品藥品檢驗所(西安 710054)

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·方藥縱橫·

變換波長HPLC同時測定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量

王云霞張鑫

西安市食品藥品檢驗所(西安 710054)

摘要目的：考察不同波長和酸度對HPLC法測定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量的影響。方法：采用Welch C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫(0-15 min 40∶60，15-50 min 40→84；60→16，50-60 min 84∶16) 柱溫30℃，流速1.0 ml/min,檢測波長284 nm(橙黃決明素)和254 nm(大黃酚)。結果：橙黃決明素和大黃酚分別在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范圍內峰面積呈良好的線性關系，相關系數(shù)r=0.9999。橙黃決明素和大黃酚的平均回收率分別為101.0%(RSD=0.8%)和99.8%(RSD=0.72%)。結論: 該方法具有準確度高，重復性好等優(yōu)點，為決明子藥材質量標準的改進提供一定依據(jù)。

主題詞決明子色譜法，高壓液相 @橙黃決明素 @大黃酚

決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子，具有清熱明目，潤腸通便的作用，臨床主要用于目赤澀痛，頭痛眩暈，目暗不明，大便秘結等癥狀[1-2]。決明子中的主要成分有蒽醌類，目前對其研究主要有單波長高效液相色譜法[2-4]，液質連用[5]，指紋圖譜法[6]對其化學成分和有效成分進行測定。本文通過采用變換波長HPLC法同時測定決明子中橙黃決明素和大黃酚的含量，并研究酸度對其含量測定的影響，經過方法學驗證，該方法具有精密度高，重現(xiàn)性好的優(yōu)點，可以用于決明子藥材的質量控制。

1儀器與試藥Agilent1260高效液相色譜儀；WelchC18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱；BT124S型電子天平(德國賽多利斯)，對照品：橙黃決明素(批號111900-201303)，含量為99.1%，大黃酚(批號110796-201017)，含量為99.6%，對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，供含量測定使用，決明子藥材經西安市食品藥品檢驗所中藥室謝志民主任藥師鑒定為豆科植物決明的干燥種子，甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，鹽酸為分析純，其它試劑均為分析純。

2方法與結果2.1色譜條件WelchUltimateXB-C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：以乙腈-0.1%磷酸為流動相梯度洗脫(0-15min40∶60，15-50min40→84；60→16，50-60min84∶16) 柱溫30℃，流速1.0ml/min，檢測波長284nm(橙黃決明素)和254nm(大黃酚)。進樣量：10μL，在此條件下測定對照品和供試品溶液，見圖1。

2.2對照品溶液的制備 精密稱取橙黃決明素10.88mg和大黃酚7.44mg至100ml容量瓶中，加無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液稀釋至刻度，作為對照品儲備液，后經稀釋制成每1ml含橙黃決明素、大黃酚分別約為20μg/ml，作為對照品溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱取本品粉末(過三號篩)0.5g，精密加入甲醇50ml，稱定重量，加熱回流2h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，蒸干，加稀鹽酸30ml置水浴中加熱水解1h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4次，每次30ml，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘渣用無水乙醇-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液溶解，轉移至25ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.4標準曲線的制備 分別精密吸取橙黃決明素和大黃酚對照品儲備溶液1ml，3ml，5ml，5ml分別稀釋至100ml，25ml，25ml，10ml和儲備液進樣10μL進行線性回歸，橙黃決明素和大黃酚的回歸方程分別為：Y=7198.122X-6.692，r=0.9999，大黃酚Y=5342.143X+26.444，r=0.9999,分別在0.01078～1.078μg，0.00741～0.741μg范圍內具有良好的線性關系。

2.5精密度試驗 精密吸取供試品溶液10μL, 連續(xù)進樣6次，進行測定，供試品溶液中橙黃決明素和大黃酚的的RSD分別為0.51%，0.38 %，結果表明該方法的精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10μL, 分別在0, 2，4，8，12，24h測定，結果橙黃決明素和大黃酚的的RSD分別為0.26%，0.43 %，表明供試品溶液在24h內穩(wěn)定性良好。

2.7重復性試驗取同一批決明子藥材，按照“2.3”項下的方法制備6份供試品溶液，進樣量10μL，結果橙黃決明素的平均含量為0.128%，RSD為1.21%，大黃酚的平均含量為0.107%，RSD為1.04%，表明本方法的重復性良好。

2.8加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的供試品6份，然后分別加入一定量的橙黃決明素和大黃酚的對照品，按照含量測定項下的方法進行測定，分別計算橙黃決明素的平均回收率為99.8%，RSD=1.25%，大黃酚的平均回收率為101.2%，RSD=1.72%。

2.9樣品含量的測定 精密稱取決明子粉末(過3號篩)0.5g，按照供試品溶液的制備方法和色譜條件進行測定，計算橙黃決明素和大黃酚的含量，結果如下：橙黃決明素含量分別為0.240%，0.119%，0.126%，大黃酚的含量分別為0.110%，0.115%，0.103%。

3討論 色譜條件的選擇：2010年版藥典中決明子含量測定采用同一波長284nm對橙黃決明素和大黃酚進行檢測，2015版仍未做修改，但是筆者在實驗中發(fā)現(xiàn)284nm下測定大黃酚具有一定的局限性，在做薄層鑒別時發(fā)現(xiàn)大黃酚的斑點非常明顯，而在液相色譜中，大黃酚峰面積較小，干擾大，當含量較低時，不易檢測，故本實驗采用變換波長法在284nm下檢測橙黃決明素，在254nm下檢測大黃酚，會大大減少干擾，提高檢測靈敏度。實驗采用不同比例的乙腈-0.1%磷酸為流動相進行等度洗脫，結果發(fā)現(xiàn)分離度不好，故采用本實驗的梯度進行洗脫，結果分離度均達到實驗要求。供試品溶液制備的考察，采用正交實驗對制備過程中水解HCl溶液濃度(5%，10%，15%)水解時間分別為(0.5h，1h，1.5h)進行考察，得到最佳方法為HCl濃度為10%，水解時間為1h時含量最高，并且我們用9種供試液對原波長進行了考察，發(fā)現(xiàn)無論哪個條件下的大黃酚峰面積變化不大，而在254nm下檢測大黃酚變化非常明顯，以本實驗條件為最佳。

參考文獻

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[3]劉富,謝志民, 傅強.變化波長高效液相色譜法同時測定鬼箭羽槲皮素和山奈酚的含量[J]. 陜西中醫(yī),2013, 34(5):598-599.

[4] 雷楊,韓宇.HPLC法測定益腎降糖丸中橙黃決明素的含量[J].臨床醫(yī)藥文獻電子雜志, 2015，(10):1794-1795.

[5] 駱宜,張樂,王衛(wèi)華,等.高效液相色譜-離子阱-飛行時間質譜鑒定決明子化學成分[J]. 藥物分析雜志,2015，(8):1408-1416.

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(收稿2016-03-22；修回2016-05-15)

【中圖分類號】282.71

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.08.067