景　發(fā),熊書名,李建平

(南通大學醫(yī)學院 外科學,江蘇 南通,226000)

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雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細胞增殖并誘導凋亡的機制

景發(fā),熊書名,李建平

(南通大學醫(yī)學院 外科學,江蘇 南通,226000)

摘要:目的探討雙去甲氧基姜黃素(BDMC)對肝癌細胞的作用及其機制。方法不同BDMC (0、20、40、80μmol/L)干預肝癌細胞株HEPG2 72 h,MTT評價細胞增殖,Tunel分析細胞凋亡,ELISA檢測活性氧(ROS)水平和p-STAT3水平,Western blot檢測AMPK。采用ROS抑制劑N-乙酰-L半胱氨酸(NAC 2.5 mmol/L)處理30 min后BDMC再干預24 h,評價細胞凋亡能力。結(jié)果BDMC可誘導肝癌細胞凋亡，增加ROS生成和AMPK磷酸化水平，抑制p-STAT3表達。抑制ROS生成可抑制BDMC誘導HEPG2凋亡的能力。結(jié)論BDMC通過ROS/AMPK/STAT3信號通路誘導肝癌細胞凋亡。

關(guān)鍵詞:雙去甲氧基姜黃素; 肝癌; 增殖; 凋亡

姜黃色素主要包括姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素,其中主要成分姜黃素具有廣譜的抗腫瘤作用，能抑制體內(nèi)外多種腫瘤細胞的生長。肝癌是威脅中國人生命健康的常見腫瘤之一，患者總體預后不是十分滿意。本實驗研究探討雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細胞生長及促進其凋亡的機制，現(xiàn)報告如下。

1材料與方法

1.1材料與試劑

人肝癌細胞株HEPG2購自中國科學院上海細胞研究所。雙去甲氧基姜黃素購自美國Sigma生物有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自美國Gibco公司。MTT試劑盒、抗氧化劑N-乙酰-L半胱氨酸(NAC)、活性氧(ROS)檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技公司。P-AMPK，p-STAT3抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。TUNEL 綠色熒光檢測試劑盒購自南京碧云天生物科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)

HEPG2細胞培養(yǎng)于10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2孵箱中，隔天更換培養(yǎng)基，細胞鋪滿培養(yǎng)瓶70%～80%時，用0.25%胰蛋白酶消化后傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3MTT實驗檢測細胞增殖能力

細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，調(diào)整細胞濃度至1×105個/L，種植于96孔板，每孔100 μL,24 h后加無血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,使細胞同步化于靜止期。棄上清，加不同濃度雙去甲氧基姜黃素(20、40、80 μmol/L),每組設(shè)5個復孔，培養(yǎng)72 h，棄上清，每孔加10 μL MTT和100 μL無血清DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h,去培養(yǎng)液，加100 μL二甲亞砜37 ℃孵育10 min完全溶解，酶標儀以測量波長490 nm測吸光度值。抑制率(%)=[1-(藥物組吸光度值/對照組吸光度值)] ×100%。

1.4熒光TUNEL檢測細胞凋亡率P

不同濃度姜黃素作用(20、40、80 μmol/L)后,PBS或HBSS洗滌1次，用4%多聚甲醛固定細胞30～60 min,用PBS或HBSS洗滌1次，加入含0.1% Triton X-100的PBS或碧云天生產(chǎn)的免疫染色洗滌液(P0106),冰浴孵育2 min。在樣品上加50 μL TUNEL檢測液,37 ℃避光孵育60 min。PBS或HBSS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長為450～500 nm,發(fā)射波長范圍為515～565 nm(綠色熒光)。

1.5ROS生成檢測

按照1∶1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使終濃度為10 μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為104/mL,37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。每隔3～5 min顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。收集細胞后，流式細胞儀檢測。

1.6Western Blot鑒定

各組細胞處理后提取總蛋白，加入上樣緩沖液,12%SDS-PAGE電泳，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜,125 mA電流下4 ℃轉(zhuǎn)膜120 min,封閉2 h,一抗(1∶200)稀釋后37℃孵育1.5 h,漂洗3次，每次5 min,孵育二抗1.5 h后漂洗，用Pierce ECL發(fā)光液(Pierce公司)顯影，凝膠成像儀成像。β-actin檢測作為內(nèi)對照。

2結(jié)果

2.1雙去甲氧基姜黃素對HEPG2細胞增殖的影響

不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用于HEPG2細胞后，細胞增殖受限，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，細胞的生長抑制率也呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，即與藥物濃度和作用時間成正相關(guān)。見圖1。HEPG2細胞在80 μmol/L BDMC作用48 h左右時達到半數(shù)抑制率。同一時間點高濃度BDMC作用的細胞抑制率顯著大于低濃度的抑制率(P<0.05)。

圖1 雙去甲氧基姜黃素抑制HEPG2細胞增殖

2.2雙去甲氧基姜黃素對HEPG2細胞凋亡的影響

不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用于HEPG2細胞72 h后，熒光TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)低濃度的BDMC(20 μmol/L)僅見少量綠色熒光，細胞發(fā)生凋亡率僅為3.1%左右。40 μmol/L BDMC作用HEPG2細胞72 h后熒光TUNEL染色提示細胞出現(xiàn)少量凋亡(13.5%)。而80 μmol/L BDMC可明顯誘導抑制HEPG2細胞發(fā)生凋亡約37.6%。見圖 2。不同濃度BDMC組間細胞凋亡率存在顯著差異(P<0.05)。

2.3雙去甲氧基姜黃素對ROS生成影響

采用碧云天公司的ROS生成檢測試劑盒檢測不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L) 作用于HEPG2細胞12 h內(nèi)細胞ROS生成的相對表達量見圖3。結(jié)果提示BDMC可明顯誘導HEPG2細胞ROS生成，并且ROS生成量與BDMC濃度成正相關(guān)，80 μmol/L BDMC誘導ROS生成量要顯著高于低濃度各組(P<0.05)。

圖2 雙去甲氧基姜黃素誘導HEPG2細胞凋亡

圖3 雙去甲氧基姜黃素促進ROS生成

2.4Western Blot檢測ROS下游p-AMPK和p-STAT3蛋白表達

上述研究表明BDMC可明顯促進ROS生成，進一步利用80 μmol/L BDMC 處理肝癌細胞48 h后，Western Blot檢測ROS下游下游信號通路蛋白的表達。本研究表明p-AMPK表達明顯增加，而p-STAT3表達明顯下降。提示BDMC抗腫瘤可能與ROS/AMPK/STAT3信號通路，作者利用ROS抑制劑NAC抑制ROS生成，其下游的p-AMPK明顯下降，而p-STAT3表達明顯升高。見圖4。

2.5ROS抑制劑NAC阻斷BDMC抗腫瘤作用

利用ROS抑制劑NAC阻斷BDMC誘導的ROS生成后，作者發(fā)現(xiàn)不同濃度BDMC (20、40、80 μmol/L)作用72 h后HEPG2細胞生長抑制率較無NAC組明顯下降，凋亡也出現(xiàn)減少。見圖5。

3討論

肝癌在中國癌癥死亡率中排名第2位，發(fā)病率為全球最高，嚴重威脅人們的身體健康[1]。隨著手術(shù)水平的提高及化療藥物的改進、放療技術(shù)的進步，肝癌治療得到一定的進展，但放化療目前副作用較大，肝癌患者的總體預后仍然不佳[2]。

姜黃色素主要包括姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素，而其中雙去甲氧基姜黃素僅占主要成分的3%[3]。目前關(guān)于雙去甲氧基姜黃素的抗腫瘤研究報道很少[4]。Yu和Xu等[5-6]研究表明，雙去甲氧基姜黃素可有效抑制肺癌細胞的侵襲和遷移。Yu和Song等[7]研究表明，雙去甲氧基姜黃素可誘導肺癌細胞凋亡。Luo等[8]發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素可通過抑制線粒體功能抑制胃腺癌的生長。

圖4 BDMC對p-AMPK和p-STAT3蛋白表達影響

圖5添加NAC后BDMC對HEPG2增殖和凋亡的影響

雙去甲氧基姜黃素對肝癌細胞作用至今研究報道仍然很少。本研究發(fā)現(xiàn)雙去甲氧基姜黃素是一種有效的天然抗腫瘤藥物，可有效抑制肝癌細胞增殖，高濃度時可誘導細胞凋亡，并且這種作用效果與雙去甲氧基姜黃素作用的時間和藥物濃度是呈正相關(guān)的。Li等[9]研究報道發(fā)現(xiàn)，人乳腺癌細胞在加入雙去甲氧基姜黃素后細胞生長明顯受到抑制，其機制可能與ROS聚集有關(guān)。因此，作者推測雙去甲氧基姜黃素抑制肝癌細胞增殖和誘導其凋亡與肝癌細胞內(nèi)ROS生成增加也有關(guān)。在肝癌HEPG2細胞中加入雙去甲氧基姜黃素后，作者發(fā)現(xiàn)ROS生成水平明顯增加，利用Western Blot證明ROS大量生成后AMPK磷酸化明顯增加，表明ROS生成增加后,AMPK被激活。Nerstedt等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞中STAT3是AMPK活化后的靶點，研究表明AMPK活化可抑制STAT3磷酸化。進一步Western Blot證明雙去甲氧基姜黃素干預后肝癌細胞中的STAT3磷酸化明顯下降，而研究認為p-STAT3表達下降，可促使Bax從胞漿遷移至線粒體，導致線粒體膜電位崩解,Cyt C釋放至胞漿，激活caspase 3級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導凋亡[11-12]。因此，作者推測雙去甲氧基姜黃素的抗肝癌作用通過ROS/AMPK/STAT3信號通路實現(xiàn)。作者利用ROS抑制劑NAC阻斷BDMC誘導的ROS生成后，雙去甲氧基姜黃素的抗腫瘤作用明顯下降，其下游信號通路p-AMPK和p-STAT3表達水平改變出現(xiàn)相反的變化，表明ROS/AMPK/STAT3信號是雙去甲氧基姜黃素的抗肝癌重要作用機制。

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收稿日期:2016-03-21

基金項目:江蘇省無錫市科技局科技支撐計劃(CSE31N1311)

通信作者:李建平,教授,E-mail:rober824919@sina.com

中圖分類號:R 735.7

文獻標志碼:A

文章編號:1672-2353(2016)15-043-04

DOI:10.7619/jcmp.201615012

Mechanism of bisdemethoxycurcumin inhabits proliferation of hepatocellular carcinoma cell and induces apoptosis

JING FA,XIONG Shuming,LI Jianping

(Surgery,Medical College of Nantong University,Nantong,Jiangsu,226000)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of bisdemethoxycurcumin (BDMC) on hepatocellular carcinoma cells.MethodsHepatoma cell line HEPG2 cells were treated with different concentrations of BDMC (0,20,40,80 μmol/L) for 72 h,and then the cell proliferation was measured by MTT.Cell apoptosis was evaluated by TUNEL analysis.ELISA was used to detect the level of intracellular reactive oxygen species (ROS) and STAT3 phosphorylation (p-STAT3),and Western blot was used to detect the expression of AMPK.Processed by ROS inhibitor N- acetyl -L cysteine (2.5 mmol/L NAC) for 30 min,cells were treated with BDMC for 24 h,and the ability of cell apoptosis was evaluated.ResultsBDMC was able to induce apoptosis of hepatocellular carcinoma cells,increase the intracellular ROS production and AMPK phosphorylation levels,and inhibit the expression of p-STAT3 protein.Inhibition of ROS formation could effectively inhibit the ability of BDMC in inducing apoptosis of HEPG2 cells.ConclusionBDMC induces apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by ROS/AMPK/STAT3 signaling pathway.

KEYWORDS:bisdemethoxycurcumin; hepatocellular carcinoma; proliferation; apoptosis