張春香，趙　輝，郭麗娜，鄭亞琳，張彩霞，劉文忠，喬利英，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

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公山羊Protamine 1 mRNA表達特性及與精液品質(zhì)相關(guān)性的研究

張春香，趙輝，郭麗娜，鄭亞琳，張彩霞，劉文忠，喬利英，任有蛇*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801)

摘要：旨在研究雄性山羊主要繁殖器官中PRM1 mRNA表達特性，分析精子PRM1 mRNA表達與精液品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性。本研究通過熒光定量PCR技術(shù)分析PRM1 mRNA表達規(guī)律，利用免疫組化技術(shù)對睪丸中PRM1蛋白進行定位，并應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件分析精子PRM1 mRNA表達量與精液品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，PRM1 mRNA在睪丸中高度表達，其次是附睪，睪丸中PRM1 mRNA表達量是附睪頭的247倍，附睪頭顯著高于附睪體和尾(P<0.05)，在剩余其他組織中微量表達。在周歲之前，睪丸中PRM1 mRNA表達量隨著月齡增加而增加，12月齡的表達量顯著高于9月齡的表達量(P<0.05)，9月齡表達量顯著高于其他低月齡的表達量(P<0.05)。精子PRM1 mRNA的表達量與精子活力(R2=0.586 0，P=0.000 5)、精子密度(R2=0.442 2，P=0.004 9)呈顯著正相關(guān)。山羊PRM1在長形精子細胞和精子細胞中表達，睪丸其他生精細胞及間質(zhì)細胞中無表達。山羊PRM1 mRNA表達具有時空表達特性，PRM1 mRNA表達量可以作為評價公羊繁殖力的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：Protamine 1；表達特性；精液品質(zhì)參數(shù)；相關(guān)性；公山羊

Protamine 1(PRM1)是成熟精子中主要的核蛋白，其富含精氨酸。PRM1在精子發(fā)生過程中長精子形成階段，替代約85%組蛋白與DNA結(jié)合[1-4]，使精子DNA凝聚[5]和染色質(zhì)重塑[6]，改變精子細胞核的形狀和數(shù)量；也可沉默一些父本基因，使精子基因印跡模式重編程[7]。PRM1表達過高或過低均可引起男性或雄鼠的繁殖障礙[8-10]。因此，PRM1在雄性精子發(fā)生及正常生殖維持中發(fā)揮重要作用。

PRM1最早是在科學(xué)家利用精子研究核蛋白過程中發(fā)現(xiàn)的[11]，直到不育男性PRM1表達異常研究結(jié)果報道后，才廣泛引起繁殖領(lǐng)域內(nèi)學(xué)者的關(guān)注[8]，因此，在男性或模型動物鼠的PRM1表達、功能及其PRM1與DNA結(jié)合機制方面的報道很多[12-15]。目前也有一些關(guān)于畜禽PRM1表達與雄性繁殖相關(guān)性的研究。有研究發(fā)現(xiàn)公牛附睪尾中精子PRM1含量顯著高于睪丸和附睪頭中精子PRM1含量，精子PRM1含量與其DNA損傷程度呈負相關(guān)[16]，有免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示非正常精子中沒有PRM1表達或僅有零星分布[17]，而且品質(zhì)好的精液PRM1 mRNA表達量高[18]。J.L.Courtens等[19]發(fā)現(xiàn)公豬PRM1分布在長形精子細胞質(zhì)中，在精子延長過程中進入細胞核，也有研究發(fā)現(xiàn)公豬附睪體精子核PRM1濃度最高，推測DNA與PRM1相互作用的關(guān)鍵位置在附睪體[20]，這與人或鼠上PRM1表達特點不一致。早在20世紀(jì)80年代就從綿羊精子頭部分離出富含精氨酸的PRM1。J.Gosálvez等[21]研究發(fā)現(xiàn)山羊和綿羊精子冷凍后，其DNA損傷顯著增加，從精子PRM1蛋白結(jié)構(gòu)分析，綿、山羊PRM1中胱氨酸殘基的數(shù)量7個，而豬的PRM1中有10個，然而并未對綿、山羊PRM1 mRNA情況進行分析。因此，本試驗以晉嵐絨山羊為試驗對象，采用熒光定量PCR研究不同組織以及不同發(fā)育階段主要生殖器官中PRM1規(guī)律，利用免疫組化技術(shù)對睪丸中PRM1進行定位，并分析精子PRM1 mRNA與精液品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性，為進一步研究山羊精子PRM1作用機制及在羊生產(chǎn)實踐中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

1.1.1組織樣品的采集2和3月齡(精子初現(xiàn)時)、5和6月齡(性成熟)、9月齡(初次配種)晉嵐絨山羊各3只，手術(shù)去勢，取睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾4種組織。12月齡(周歲)晉嵐絨山羊3只，頸靜脈放血致死，取肝、心、脾、腎、肺、腹肌、背最長肌、小腸、大腸、睪丸、附睪頭、附睪體和附睪尾13種組織，迅速放入RNA固相清除劑處理過的2.0 mL 凍存管，置于液氮中，于-80 ℃冰箱保存。試驗動物由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技試驗站羊場提供。另取相同部位的睪丸，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小，在4%(重量/體積)的多聚甲醛固定24 h后轉(zhuǎn)移至75%乙醇溶液中保存。

1.1.2精液樣品的采集12月齡晉嵐絨山羊8只，單獨飼喂，飼養(yǎng)條件一致，試驗羊每隔7 d使用電刺激法采精一次，電壓0.6 V，根據(jù)反應(yīng)調(diào)高電壓0.1～0.2 V，刺激時間為3～5 s，間歇5～8 s，用集精杯收集精液。精液轉(zhuǎn)移至離心管后，以37 ℃水浴保存，送至實驗室進行相關(guān)指標(biāo)測定，精液品質(zhì)檢測后，放入-80 ℃冰箱保存，供提取總RNA使用。

1.2主要試劑

PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒、Trizol Reagent試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒購自TaKaRa公司，黃色DAB染料和即用型SABC免疫組化試劑盒購自博士德公司，Rabbit Anti-Protamine 1多克隆一抗購自Bioworld公司，其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3試驗方法

1.3.1精液品質(zhì)檢查精液量由離心管刻度讀出；在37 ℃下用稀釋液(Tris 27.1 g·L-1，檸檬酸14.0 g·L-1，果糖10 g·L-1)進行10倍稀釋，在400倍顯微鏡下，取5個不同視野觀察精子運動狀態(tài)，對直線前進運動精子進行計數(shù)，取其平均值為該樣品的精子活力；精子密度采用血細胞計數(shù)板進行測定，取5個不同視野求其平均值。1.3.2總RNA提取參照Trizol Reagent試劑盒操作說明進行。用ND-1000核酸蛋白測定儀檢測總RNA濃度和純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性，然后將濃度調(diào)整為1 000 ng·μL-1，-80 ℃保存。1.3.3cDNA合成總RNA反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒操作說明，10 μL反應(yīng)體系：5×PrimeScriptTMRT Master Mix 2.0 μL，總RNA 0.5 μL，Rnase-free水7.5 μL；反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s；產(chǎn)物-20 ℃保存。

1.3.4引物設(shè)計與合成參照山羊PRM1序列和18S rRNA序列，引物序列見表1。合成由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

表1　PRM1和18S rRNA引物序列

1.3.5常規(guī)RT-PCR檢測參照李振等[22]方法。15 μL反應(yīng)體系：TaqDNA聚合酶(125 U) 0.5 μL，10×PCR Buffer 1.5 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 2 μL，上下游引物(10 pmol·L-1)各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL，ddH2O 8.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。用3.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，檢測合格后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.3.6相對定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照李振等[22]和任有蛇等[23-24]方法進行。反轉(zhuǎn)錄所得的PRM1和18S rRNA cDNA按照2×稀釋5個梯度，使各PCR反應(yīng)體系中起始模板數(shù)分別是25、24、23、22、2，陰性對照為不添加模板的空白，20 μL反應(yīng)體系：cDNA模板2.0 μL，Rox Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，引物1.6 μL，ddH2O 6.0 μL和SYBR Premix Ex TaqTM10 μL。擴增條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，45個循環(huán)；熔解曲線階段，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。在每個退火或延伸步驟結(jié)束時檢測熒光值，結(jié)果由ABI7500型實時PCR系統(tǒng)v2.0.6軟件導(dǎo)出。

1.3.7熒光定量PCR反應(yīng)體系同1.3.6，每個樣本重復(fù)3次，以18S rRNA為內(nèi)參校正，結(jié)果由2-ΔΔCT方法計算。

1.3.8免疫組化分析參照張春香等[25]和任有蛇等[26]方法進行，組織經(jīng)常規(guī)脫水、浸蠟后制作石蠟切片，切片厚度5 μm。每一步更換液體先用PBS洗3次，每次5 min。切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫孵育10 min；pH 7.5的檸檬酸緩沖液中95 ℃熱修復(fù)15 min，自然冷卻；5% BSA 37 ℃封閉15 min，甩去多余液體；1∶100稀釋的多克隆Rabbit Anti-PRM 1一抗4 ℃過夜孵育；生物素標(biāo)記的單克隆Goat Anti-Rabbit二抗37 ℃孵育20 min；ABC復(fù)合物37 ℃20 min；黃色DAB顯色5 min；蘇木精復(fù)染30 s后沖洗，然后鹽酸乙醇分化；最后把切片脫水、透明、封片。同時用PBS代替一抗做陰性對照。在Olympus生物顯微鏡下觀察，用Image-pro plus 7.0拍照并分析平均光密度值。

1.4圖像分析與數(shù)據(jù)處理

以12月齡附睪尾為對照，用-△△CT法計算PRM1相對表達量。用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，單因素方差分析(ANOVA)對生殖器官PRM1 mRNA和蛋白表達量進行差異顯著性檢驗。精子PRM1 mRNA表達量與精液品質(zhì)的相關(guān)性分析用GraphPad Prism 5軟件中Correlation程序。作圖用GraphPad Prism 5軟件。

2結(jié)果

2.1總RNA提取及常規(guī)RT-PCR檢測

各組織總RNA濃度和純度的檢測結(jié)果顯示，A260 nm/A280 nm均為1.8～2.0。1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖1A)顯示28S rRNA、18S rRNA條帶完整、清晰，說明所提取RNA符合反轉(zhuǎn)錄要求?？俁NA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以睪丸組織cDNA為模板進行目的基因擴增，經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1B)，條帶單一、清晰，說明擴增產(chǎn)物特異性強，可進行后續(xù)試驗。PCR產(chǎn)物回收后測序，其測序結(jié)果與已登錄的山羊PRM1的序列(GenBank，No.HM773246)相似性達100%，說明該序列即為山羊PRM1 mRNA部分序列，可進行下一步試驗。

A.總RNA檢測；B.PCR擴增產(chǎn)物檢測A.Agarose gel electrophoresis pattern of total RNA；B.Agarose gel electrophoresis pattern of PCR production圖1　總RNA及PRM1 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂糖膠電泳Fig.1　Agarose gel electrophoresis pattern of total RNA and PRM1 PCR production

2.2不同組織中PRM1 mRNA表達量

PRM1和18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。圖2A顯示在5個數(shù)量級梯度上PRM1和18S rRNA呈良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)分別為0.999和0.992，擴增效率在95%～110%，說明該相對定量檢測方法有效。擴增曲線(圖2B)基線平穩(wěn)，拐點清楚；熔解曲線(圖2C)起峰單一，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體，保證試驗的可靠性。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線；B.擴增曲線；C.熔解曲線A.Standard curves；B.PCR amplification plots；C.Dissociation curves圖2　PRM1與18S rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curves for PRM1 and 18S gene

13種組織中PRM1 mRNA表達見圖3。圖3顯示PRM1在山羊各組織間表達差異變化明顯：睪丸>>附睪頭>附睪體、附睪尾>肝、肺>小腸、腹肌、脾、大腸、心、背最長肌和腎。PRM1在睪丸的表達水平是附睪頭、體和尾表達量的247、6 511和10 157倍。附睪頭中表達顯著高于附睪體和尾(P<0.05)，其表達量是附睪體26倍，附睪尾41倍。附睪體和尾PRM1表達水平顯著高于肝和肺(P<0.05)；在小腸、腹肌、脾、大腸、心、背最長肌和腎中有微量表達。

2.3不同月齡公山羊主要生殖器官PRM1 mRNA表達量

不同月齡公山羊主要生殖器官PRM1 mRNA表達量分析結(jié)果見圖4。從圖4可以看出，不同月齡公山羊睪丸中PRM1 mRNA表達量隨月齡的增加而顯著增加，12月齡PRM1 mRNA表達量顯著高于9月齡的表達量(P<0.05)，9月齡的表達量顯著高于其他低月齡的表達量(P<0.05)，9月齡和12月齡的睪丸中PRM1 mRNA表達量分別是2月齡的315倍和453倍。附睪頭中PRM1 mRNA表達量6月齡的顯著高于9和12月齡的(P<0.05)，極顯著高于2和3月齡的(P<0.01)。附睪體和尾中PRM1 mRNA表達量隨月齡的增加而增加，9和12月齡附睪體PRM1 mRNA表達量顯著高于6月齡的表達量(P<0.05)，極顯著高于2、3和5月齡的(P<0.01)；6、9和12月齡附睪尾PRM1 mRNA表達量顯著高于3和5月齡的表達量(P<0.05)，極顯著高于2月齡的表達量(P<0.01)。同一月齡睪丸中PRM1 mRNA表達量均顯著高于附睪頭的(P<0.05)，極顯著高于附睪體和尾(P<0.01)。附睪頭PRM1 mRNA表達量均顯著高于附睪體和尾的(P<0.05)。

1.睪丸；2.附睪頭；3.附睪體；4.附睪尾；5.心；6.肝；7.脾；8.肺；9.腎；10.大腸；11.小腸；12.腹??；13.背最長??；相隔和相鄰字母分別表示差異極顯著(P<0.01)；顯著(P<0.05)，同行相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同1.Testes；2.Caput；3.Corpus；4.Cauda；5.Heart；6.Liver；7.Spleen；8.Lung；9.Kidney；10.Intestinum crassum；11.Small intestine；12.Abdominal muscle；13. Longissimus dorsi muscle.The alternative letters in the same line are very significantly different (P<0.01)，The adjacent letters in the same line are significantly different (P<0.05)；Values with the same letters are no significantly different (P>0.05).The same as below圖3　公山羊組織PRM1 mRNA表達量Fig.3　Relative expression of PRM 1 mRNA in different tissues of bucks

2.4精子PRM1 mRNA表達量與精液品質(zhì)參數(shù)相關(guān)性分析

精子PRM1 mRNA表達量與精液品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析見圖5。從圖5A可以看出精子PRM1 mRNA表達量與射精量相關(guān)性接近顯著(P=0.063 2)。圖5B和5C結(jié)果顯示精子PRM1 mRNA表達量與精子活力和精子密度呈顯著正相關(guān)性(P=0.000 5和P=0.004 9)，R2分別為0.586 0和0.442 2。

不同大寫字母表示同一月齡不同器官的差異顯著性，不同小寫字母表示不同月齡同一器官的差異顯著性Values with the different capital letters are significant difference in different reproductive organs at same age(P<0.05)；Values with the different small letters are significant difference in same reproductive organs at different age(P<0.05)圖4　不同月齡山羊主要繁殖器官PRM1 mRNA相對表達量Fig.4　Relative expression of PRM1 mRNA in reproductive organ at different age

2.5PRM1蛋白在睪丸中的定位

免疫組化技術(shù)對3、6和12月齡睪丸PRM 1蛋白定位結(jié)果如圖6，根據(jù)生精波的規(guī)律和核的形狀，初步將PRM 1蛋白定位在長形精子細胞和精子中，而在其他生精細胞及間質(zhì)細胞中沒有檢測到陽性信號。睪丸免疫組化結(jié)果光密度值分析見圖7，6和12月齡光密度值顯著高于3月齡的(P<0.05)6和12月齡光密度值分別是3月齡的14.6和17.0倍。

3討論

3.1PRM1 mRNA表達特性

圖5　PRM1 mRNA相對表達量與精液品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性分析Fig.5　Correlative analyse between relative expression of PRM1 mRNA and index of semen quality

A、C和E.PRM1在3、6和12月齡睪丸檢測到陽性產(chǎn)物；B、D和F.3、6和12月齡睪丸陰性對照；SSCs.精原干細胞；PS.初級精母細胞；ELS.長形精子細胞；S.精子；I.睪丸間質(zhì)細胞A，C and E.PRM1 in 3-month-old，6-month-old and 12-month-old testis showed a positive signal；B，D and F.The negative control of 3-，6- and 12-month-old testis；SSCs.Spermatogonial stem cells；PS.Primary spermatocyte；ELS.Elongating spermatids；S.Spermatozoon；I.Interstitial cell圖6　睪丸組織PRM1免疫組化 400×Fig.6　Immunohistochemistry of PRM1 protein in caprine testis 400×

圖7　平均光密度值分析Fig.7　Analysis of the mean optical density

3.1.1不同組織PRM1 mRNA表達特性最初PRM1是從精子的頭部分離得到的[11]。利用Northern blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)在人類和鼠類只在睪丸中PRM1特異表達[27-28]，而腦組織和肝中無表達；滕小梅等利用RT-PCR技術(shù)瓊脂糖電泳檢測了15種人類組織(不包括附睪)PRM1表達情況，發(fā)現(xiàn)除睪丸和結(jié)腸癌組織外其余組織無PRM1表達[29]，隨后侯文佳等[30]發(fā)現(xiàn)在人類正常結(jié)腸組織中也有微量的PRM1 mRNA。本研究檢測山羊13種組織中均存在不同程度表達，PRM1在睪丸表達量最高，其次是附睪頭，主要繁殖器官以外的組織都是微量表達，其相對表達量為0.002～0.200，這與人和鼠上的結(jié)果有差異，造成這種差異原因主要是檢測PRM1 mRNA的技術(shù)手段不同，隨著技術(shù)手段的改進，檢測的精確度越來越高，因此，還需要在其他動物上進一步驗證。3.1.2年齡對動物睪丸和附睪PRM1 mRNA表達的影響有研究發(fā)現(xiàn)小鼠在出生后7～8 日齡無PRM1 mRNA表達，在24～26日齡時PRM1 mRNA被檢測到，且隨著日齡的增加PRM1表達量持續(xù)增加[28]。本研究結(jié)果顯示在2～3月齡精子初現(xiàn)時已經(jīng)有PRM1的表達，到性成熟時5～6月齡時增加，9～12月齡時顯著增加，與前人研究結(jié)果基本一致。目前有關(guān)年齡對附睪PRM1 mRNA表達影響的研究較少，基本趨勢是與睪丸一致，附睪頭中的表達量顯著高于附睪體和尾，這可能是附睪頭處PRM1仍與DNA發(fā)生作用。公豬附睪體精子核PRM1濃度最高，推測DNA與PRM1作用關(guān)鍵位置在附睪體[20]。本研究用的是從mRNA水平上定量附睪的組織PRM1表達量，而在公豬研究上用免疫組織化學(xué)方法研究附睪中精子核中PRM1蛋白濃度，本研究中6月齡附睪頭PRM1 mRNA最高，有可能是山羊6月齡達到性成熟大量精子出現(xiàn)在附睪頭中的原因，另外還需進一步研究其PRM1蛋白是否也表達最高呢？因此，下一步將對山羊附睪及其中的精子PRM1蛋白進行定量分析，探討PRM1作用的規(guī)律。

3.2PRM1 mRNA含量與精液品質(zhì)參數(shù)的相關(guān)性

現(xiàn)已有研究報道精子PRM1 mRNA表達量可作為評價雄性生殖力的指標(biāo)，在人上，有生殖障礙男性精子PRM1 mRNA含量較低，DNA損傷較為嚴(yán)重[31-32]。公牛和種馬精子質(zhì)量和精子受精能力參數(shù)均與PRM1 mRNA表達量正相關(guān)[17，33]，含PRM1高的精子其DNA損傷較低[16]，正常精子PRM1 mRNA表達量顯著高于有運動障礙的精子的表達量[18]。還有研究顯示PRM1能影響精子頭部大小，使精子流動性發(fā)生變化[34]，導(dǎo)致活力改變[35]。本研究結(jié)果顯示PRM1 mRNA表達量與精子密度和精子活力顯著正相關(guān)。高活力山羊精液(>0.8)精子PRM1 mRNA含量顯著高于低活力精液(<0.5)PRM1 mRNA含量，說明在山羊上，PRM1 mRNA表達量也可以作為評價公羊繁殖力的指標(biāo)，但仍需進一步研究睪丸和精子PRM1 mRNA含量與精子DNA損失的關(guān)系。

3.3睪丸中PRM 1蛋白定位

在圓形精子細胞向長形精子細胞分化時，PRM1代替組蛋白與DNA結(jié)合形成Protamine-DNA復(fù)合體[12-13]，促進染色體的凝聚和濃縮[14-15]。利用免疫電鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)人類和大鼠精子發(fā)生過程中PRM1首先出現(xiàn)在長形精子細胞中[36-38]；費仁仁等[39]利用速度沉降法和超聲法發(fā)現(xiàn)，睪丸圓形精子細胞核內(nèi)全部為組蛋白，長形精子細胞核內(nèi)主要為PRM1，也存在少量過渡型蛋白和組蛋白，附睪精子核中絕大部分為PRM1，同時該研究還利用免疫組織化學(xué)和同位素標(biāo)記方法進一步證明，只有在長形精子細胞核內(nèi)檢測到PRM1。本研究免疫組化結(jié)果初步將山羊PRM1蛋白定位于長形精子細胞和精子中，睪丸其他生精細胞及間質(zhì)細胞中無表達，與人和鼠睪丸中PRM1表達規(guī)律基本一致，仍需進一步分離睪丸中不同發(fā)育階段的精細胞，通過不同生物技術(shù)手段進行精確定位。相對光密度值顯示PRM1蛋白與mRNA的表達趨勢一致。目前，首先需要合成抗山羊PRM1單克隆抗體，進一步利用先進生物技術(shù)研究山羊睪丸和附睪PRM1表達模式。

4結(jié)論

山羊PRM1 mRNA表達具有組織特異性，其在睪丸中高度表達，其次是附睪；山羊主要繁殖器官中PRM1 mRNA具有時間依賴性，在周歲之前隨著月齡增加表達量增加；精子PRM1 mRNA的表達量與精子活力、精子密度呈顯著正相關(guān)；山羊睪丸中PRM1在長形精子細胞與精子中表達。PRM1 mRNA表達量也可以作為評價公羊生育力的指標(biāo)，但仍需進一步利用先進生物技術(shù)研究山羊睪丸和附睪PRM1表達模式，探討PRM1作用的規(guī)律。

參考文獻(References)：

[1]HECHT N B.Regulation of ‘haploid expressed genes’ in male germ cells[J].JReprodFertil，1990，88(2)：679-693.

[2]OLIVA R，DIXON G H.Vertebrate protamine gene evolution I.Sequence alignments and gene structure[J].JMolEvol，1990，30(4)：333-346.

[3]DADOUNE J P.The nuclear status of human sperm cells[J].Micron，1995，26(4)：323-345.

[4]STEGER K.Transcriptional and translational regulation of gene expression in haploid spermatids[J].AnatEmbryol，1999，199(6)：471-487.

[5]DEROUCHEY J E，RAU D C.Role of amino acid insertions on intermolecular forces between arginine peptide condensed DNA helices：implications for protamine-DNA packaging in sperm[J].JBiolChem，2011，286(49)：41985-41992.

[6]DOYEN C M，MOSHKIN Y M，CHALKLEY G E，et al.Subunits of the histone chaperone CAF1 also mediate assembly of protamine-based chromatin[J].CellRep，2013，4(1)：59-65.

[7]AOKI V W，CARRELL D T.Human protamines and the developing spermatid：their structure，function，expression and relationship with male infertility[J].AsianJAndrol，2003，5(4)：315-324.

[8]STEGER K，F(xiàn)INK L，F(xiàn)AILING K，et al.Decreased protamine-1 transcript levels in testes from infertile men[J].MolHumReprod，2003，9(6)：331-336.

[9]ALEEM M，PADWAL V，CHOUDHARI J，et al.Sperm protamine levels as indicators of fertilising potential in sexually mature male rats[J].Andrologia，2008，40(1)：29-37.

[10]AOKI V W，LIU L，CARRELL D T.Identification and evaluation of a novel sperm protamine abnormality in a population of infertile males[J].HumReprod，2005，20(5)：1298-1306.

[11]POLLISTER A W，MIRSKY A E.The nucleoprotamine of trout sperm[J].JGenPhysiol，1946，30(2)：101-116.

[12]BREWER L R，CORZETT M，LAU E Y，et al.Dynamics of protamine 1 binding to single DNA molecules[J].JBiolChem，2003，278(43)：42403-42408.

[13]CREE L H，BALHORN R，BREWER L R.Single molecule studies of DNA-protamine interactions[J].ProteinPeptLett，2011，18(8)：802-810.

[14]BREWER L R，CORZETT M，BALHORN R.Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule[J].Science，1999，286(5437)：120-123.

[15]BALHORN R，BREWER L，CORZETT M.DNA condensation by protamine and arginine-rich peptides：analysis of toroid stability using single DNA molecules[J].MolReprodDev，2000，56(2 Suppl)：230-234.

[16]FORTES M R，SATAKE N，CORBET D H，et al.Sperm protamine deficiency correlates with sperm DNA damage in Bos indicus bulls[J].Andrology，2014，2(3)：370-378.

[17]DOGAN S，VARGOVIC P，OLIVEIRA R，et al.Sperm protamine-status correlates to the fertility of breeding bulls[J].BiolReprod，2015，92(4)：92.

[18]GANGULY I，GAUR G K，KUMAR S，et al.Differential expression of protamine 1 and 2 genes in mature spermatozoa of normal and motility impaired semen producing crossbred Frieswal (HF× Sahiwal) bulls[J].ResVetSci，2013，94(2)：256-262.

[19]COURTENS J L，PL?EN L，LOIR M.Immunocytochemical localization of protamine in the boar testis[J].JReprodFertil，1988，82(2)：635-643.

[20]RODRIGUEZ-MARTINEZ H，COURTENS J L，KVIST U，et al.Immunocytochemical localization of nuclear protamine in boar spermatozoa during epididymal transit[J].JReprodFertil，1990，89(2)：591-595.

[22]李振，任有蛇，焦光月，等.雄激素受體基因在綿羊公羔不同組織中的表達特性及性腺中的定位[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2013，43(8)：1251-1257.

LI Z，REN Y S，JIAO G Y，et al.The expression of androgen receptor gene in different tissues and cellular localization in gonad of male sheep lambs[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2013，43(8)：1251-1257.(in Chinese)

[23]任有蛇，張國林，郭麗娜，等.公山羊β防御素104a生物信息學(xué)分析及表達特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46(2)：219-227.

REN Y S，ZHANG G L，GUO L N，et al.Bioinformatics analysis and expression characteristics of goat beta-defensin 104a gene in adult bucks[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(2)：219-227.(in Chinese)

[24]任有蛇，秦小偉，郭麗娜，等.日糧納米鋅水平對公羊睪丸和附睪Cu-ZnSOD表達的影響[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2014，45(10)：1622-1630.

REN Y S，QIN X W，GUO L N，et al.Effect of the supplementation of different nano-zinc levels on expression of copper zinc superoxide in testis and epididymis of ram lambs[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2014，45(10)：1622-1630.(in Chinese)

[25]張春香，秦小偉，郭麗娜，等.納米鋅水平對公羊精液品質(zhì)、抗氧化酶活性及附睪Cu-ZnSOD表達的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48(1)：154-164.

ZHANG C X，QIN X W，GUO L N，et al.Effect of different Nano-zinc levels in dietary on semen quality，activities of antioxidant enzyme and expression of copper zinc superoxide in epididymis of ram lambs[J].ScientiaAgriculturaSinica，2015，48(1)：154-164.(in Chinese)

[26]任有蛇，郭麗娜，張春香，等.山羊Lcn 5的表達特點及其在繁殖器官中定位[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2015，46(5)：711-718.

REN Y S，GUO L N，ZHANG C X，et al.Expression characteristics of Lcn 5 and its localization in reproduction organ of bucks[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica，2015，46(5)：711-718.(in Chinese)

[27]DOMENJOUD L，KREMLING H，BURFEIND P，et al.On the expression of protamine genes in the testis of man and other mammals[J].Andrologia，1991，23(5)：333-337.

[28]FEI R R，JI L，WU X F，et al.Studies on expression of P1 protamine gene in rat and mouse testis[J].Reproduction&Contraception，1999，10(4)：195-202.

[29]滕小梅，韓澤廣，黃健.PRM1，一個新的候選結(jié)腸癌相關(guān)CT抗原基因的識別及其在結(jié)腸癌組織中的表達分析[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，23(3)：1-4.

TENG X M，HAN Z G，HUANG J.Identification and expression analysis of PRM1 as a novel candidate cancer/testis gene in human colorectal cancer[J].JournalofModernLaboratoryMedicine，2008，23(3)：1-4.(in Chinese)

[30]侯文佳，陳芳芳，任平，等.魚精蛋白 1 在結(jié)腸腺癌組織中的表達及其臨床意義[J].中國生物制品學(xué)雜志，2013，26(5)：698-700，709.

HOU W J，CHEN F F，REN P，et al.Expression and significance of protamine 1 in human colon adenocarcinoma tissue[J].ChineseJournalofBiologicals，2013，26(5)：698-700，709.(in Chinese)

[31]NILI H A，MOZDARANI H，ALEYASIN A.Correlation of sperm DNA damage with protamine deficiency in Iranian subfertile men[J].ReprodBiomedOnline，2009，18(4)：479-485.

[32]STEGER K，WILHELM J，KONRAD L，et al.Both protamine-1 to protamine-2 mRNA ratio and Bcl2 mRNA content in testicular spermatids and ejaculated spermatozoa discriminate between fertile and infertile men[J].HumReprod，2008，23(1)：11-16.

[33]PARADOWSKA-DOGAN A，F(xiàn)ERNANDEZ A，BERGMANN M，et al.Protamine mRNA ratio in stallion spermatozoa correlates with mare fecundity[J].Andrology，2014，2(4)：521-530.

[34]LüKE L，CAMPBELL P，VAREA SNCHEZ M，et al.Sexual selection on protamine and transition nuclear protein expression in mouse species[J].ProcBiolSci，2014，281(1783)：76-80.

[35]RETTIE E C，DORUS S.Drosophila sperm proteome evolution：Insights from comparative genomic approaches[J].Spermatogenesis，2012，2(3)：213-223.

[36]MEISTRICH M L，TROSTLE-WEIGE P K，VAN BEEK M E.Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis[J].BiolReprod，1994，51(2)：334-344.

[37]LESCOAT D，BLANCHARD Y，LAVAULT M T，et al.Ultrastructural and immunocytochemical study of P1 protamine localization in human testis[J].Andrologia，1993，25(2)：93-99.

[38]LE LANNIC G，ARKHIS A，VENDRELY E，et al.Production，characterization，and immunocytochemical applications of monoclonal antibodies to human sperm protamines[J].MolReprodDev，1993，36(1)：106-112.

[39]費仁仁，鄧錦松，紀(jì)林，等.大鼠精子細胞變態(tài)期核蛋白轉(zhuǎn)換的研究[J].解剖學(xué)報，1997，28(4)：388-392.

FEI R R，DENG J S，JI L，et al.Studies on rat spermatid nuclear protein transition[J].ActaAnatomicaSinica，1997，28(4)：388-392.(in Chinese)

(編輯程金華)

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.07.007

收稿日期：2016-01-22

基金項目：山西省科技攻關(guān)計劃項目(20130311025-2；20110311029)

作者簡介：張春香(1972-)，女，山西侯馬人，副教授，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究,Tel:0354-6285990,E-mail：zhchx66@126.com *通信作者：任有蛇，教授，主要從事動物繁殖調(diào)控研究,E-mail：rys925@126.com

中圖分類號：S827.2

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號:0366-6964(2016)07-1354-09

Expression Profiles of Protamine 1 mRNA and Correlation with Index of Semen Quality in Bucks

ZHANG Chun-xiang，ZHAO Hui，GUO Li-na，ZHENG Ya-lin，ZHANG Cai-xia，LIU Wen-zhong，QIAO Li-ying，REN You-she*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，China)

Abstract:The aims of this study were to evaluate the expression profiles of Protamine 1(PRM1) mRNA in reproductive organs of bucks and to analyze the correlation between expression of PRM1 mRNA in spermatozoa and semen quality index.In this experiment，mRNA expression was detected by real-time fluorescent quantitative PCR.Cellular localization of PRM1 in testis was examined by immunohistochemistry.The correlation was analyzed by GraphPad Prism 5 software.The results showed that：the expression of PRM1 mRNA in testis was the highest in all tissue detected，which was 247 times higher than that in the epididymal caput(P<0.05).The expression of PRM1 mRNA in epididymal caput was significantly higher than that in epididymal corpus and cauda(P<0.05).The expression of PRM1 mRNA in other tissues was very few.The expression of PRM1 mRNA in testis was gradually increased with the increase of ages in one year old.The PRM1 mRNA expression in testis at 12 months old were significantly higher than that at 9 months old(P<0.05).The PRM1 mRNA expression in testis at 9 months old was significantly higher than that in other ages.Concentration of PRM1 mRNA in sperm was positively correlated with the sperm motility (R2=0.586 0，P=0.000 5) and sperm concentration (R2=0.442 2，P=0.004 9).PRM1 was located in elongating spermatids and spermatozoa in testis of bucks.There was no positive signal in other cells of testis.This study indicated that the expression of PRM1 mRNA was spatial and temporal-specific pattern.The sperm PRM1 mRNA content could be index of fertility of bucks.

Key words:Protamine 1；expression profiles；index of semen quality；correlation；bucks