陳　晶　李巧霞　李　瑋　李　宏　湯　菲　王縛鯤

(中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科,石家莊050082)

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Allicin對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用及可能機(jī)制

陳晶李巧霞①李瑋李宏①湯菲王縛鯤

(中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科,石家莊050082)

[摘要]目的：明確Allicin對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用并進(jìn)一步分析可能的機(jī)制。方法：將24只8周齡雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組：Control組：陰性對(duì)照；DSS組：2.5%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎；Allicin組：2.5%DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎+Allicin治療[10 mg/(kg·d),共7 d]。結(jié)果：與DSS組比較，Allicin組疾病活動(dòng)度評(píng)分及腸道炎癥評(píng)分顯著降低(P<0.05)。Allicin治療組小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著低于DSS組。Allicin治療組小鼠腸黏膜炎癥因子(IL-6、IL-1β及TNF-α)水平顯著低于DSS組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與DSS組比較，Allicin治療顯著抑制了腸黏膜p-JAK2及p-STAT3的表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論：Allicin對(duì)DSS小鼠腸炎具有治療作用，可能的機(jī)制包括抗炎，保護(hù)腸上皮細(xì)胞及抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路等。

[關(guān)鍵詞]Allicin；動(dòng)物模型；潰瘍性結(jié)腸炎；凋亡；炎癥

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的炎癥性腸病，病變可累及全結(jié)直腸。該病病程表現(xiàn)為復(fù)發(fā)與緩解相交替，無法治愈，患者有終身復(fù)發(fā)傾向。目前UC的發(fā)病機(jī)制并不清楚，但認(rèn)為與遺傳易感、腸道菌群及黏膜免疫異常等因素有關(guān)[1]。目前的藥物治療效果并不理想，且多數(shù)藥物具有較為明顯的毒副作用[2]。開發(fā)新藥物有利于提高該病的治療水平。在基礎(chǔ)研究中常采用葡聚糖硫酸鈉(Dextra sulfate sodium，DSS)建立小鼠結(jié)腸炎模型。DSS小鼠結(jié)腸炎模型是國(guó)際公認(rèn)的UC動(dòng)物模型[3]。Allicin是一種大蒜提取物，新近的研究表明Allicin具有抗炎、抗菌及抗腫瘤等多種功能[4,5]。我們嘗試采用Allicin治療DSS小鼠結(jié)腸炎，以期為UC的治療尋找可能的新藥物。

1材料與方法

1.1分組及干預(yù)將24只雄性BALB/c小鼠[體質(zhì)量(24.8±2.5)g]飼養(yǎng)于SPF環(huán)境下；控制室內(nèi)溫度在25～27℃；防止噪聲及強(qiáng)光燈干擾；小鼠自由飲水和進(jìn)食。小鼠長(zhǎng)至8周齡[體質(zhì)量(24.8±2.5)g]時(shí)隨機(jī)分為Control組、DSS組及Allicin組，每組8只。每組小鼠接受如下干預(yù)：Control組：陰性對(duì)照；DSS組：采用DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎；Allicin組：DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎+Allicin(Abcam，USA)治療[10 mg/(kg·d),灌胃給藥，共7 d]。

DSS組及Allicin組建立DSS結(jié)腸炎模型的方法依據(jù)Cooper等[6]的推薦：采用2.5%DSS(MP Biochemicals,USA)溶液取代實(shí)驗(yàn)小鼠的飲用水，共7天。第8天脫頸處死小鼠，取結(jié)腸組織分別儲(chǔ)存于-80℃冰箱及福爾馬林固定。

1.2檢測(cè)及評(píng)估指標(biāo)評(píng)估小鼠疾病活動(dòng)情況：實(shí)驗(yàn)期間觀察并記錄小鼠疾病活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)，并評(píng)估疾病活動(dòng)度指數(shù)(Disease activity index,DAI)[3]：稀便(1分)、便血(1分)、直腸脫垂(1分)、毛發(fā)豎立(1分)，嚴(yán)重直腸脫垂及嚴(yán)重腹瀉情況各加1分，累計(jì)得分為小鼠DAI最終得分。

評(píng)估小鼠腸道炎癥：蘇木素伊紅染色后光學(xué)顯微鏡下觀察，并計(jì)算腸道炎癥評(píng)分[7]：共0～4分，分?jǐn)?shù)越高代表腸道炎癥越重。

評(píng)估小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡情況：參照說明書，采用商品化TUNEL試劑盒(Roche,瑞士)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞凋亡。

評(píng)估小鼠腸黏膜炎癥因子水平：刮取腸黏膜組織后勻漿，采用商品化ELISA試劑盒(R&D，美國(guó))法檢測(cè)白介素10(Interleukin-10，IL-10)、白介素6(Interleukin-6，IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)。

評(píng)估小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號(hào)通路的改變：采用Western blot法檢測(cè)p-JAK2及p-STAT3，具體操作方法參照文獻(xiàn)[8]，簡(jiǎn)述：提取并采用Bradford法定量蛋白，置入5×loading沸水中煮10 min(1∶4比例)，使之變性，每孔加入35 μg蛋白，電泳、轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入JAK2、STAT3或β-actin(1∶1 000，R&D公司)一抗，搖床12 h(4℃)，滴加二抗后洗膜，顯影后行灰度值分析(Image J軟件)。

2結(jié)果

2.1Allicin對(duì)DSS小鼠的治療效果三組小鼠疾病活動(dòng)度評(píng)分見圖1。Allicin治療組小鼠疾病活動(dòng)度評(píng)分顯著低于DSS組小鼠，相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

三組小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)圖片及腸道炎癥評(píng)分見圖2。Allicin組小鼠腸道炎癥評(píng)分顯著低于DSS，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2Allicin對(duì)DSS小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的影響如圖3所示，Control組小鼠腸上皮細(xì)胞未見明顯凋亡，DSS組小鼠上皮細(xì)胞凋亡明顯。Allicin組小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著低于DSS組小鼠，相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3Allicin對(duì)DSS小鼠腸黏膜炎癥因子水平的影響三組小鼠腸黏膜炎癥因子水平見圖4。三組腸黏膜IL-10水平相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Allicin組小鼠腸黏膜IL-6、IL-1β及TNF-α水平顯著低于DSS組小鼠，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4Allicin對(duì)DSS小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響圖5顯示，Allicin治療組小鼠腸黏膜p-JAK2及p-STAT3水平，相比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　小鼠疾病活動(dòng)度評(píng)分比較Fig.1　Compare of disease activity index among three groupsNote: *.P<0.05.

圖2　小鼠腸道炎癥評(píng)分比較Fig.2　Compare of inflammatory scores among three groupsNote: *.P<0.05.

圖3　小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡情況比較Fig.3　Compare of intestinal epithelial cell apoptosis among three groupsNote: *.P<0.05.

圖4　小鼠腸黏膜炎癥因子水平的比較Fig.4　Compare of intestinal mucosa inflammation factors among three groupsNote: *.P<0.05.

圖5　Allicin對(duì)DSS小鼠腸黏膜JAK2/STAT3信號(hào)通路的影響Fig.5　Impact of Allicin on JAK2/STAT3 signal pathway in intestinal mucosaNote: *.P<0.05.

3討論

UC的治療是一個(gè)世界性難題，病情反復(fù)且不可治愈，部分患者可并發(fā)惡性腫瘤[9]。隨著我國(guó)UC的發(fā)病率不斷升高也引起了胃腸科醫(yī)生的高度重視。雖然可以通過手術(shù)切除全結(jié)腸以徹底治療該病，但這種致殘性手術(shù)會(huì)顯著影響患者的生活質(zhì)量。且多數(shù)患者疾病癥狀并不重，可通過藥物延緩疾病進(jìn)展。但目前臨床多采用免疫抑制劑治療UC，其副作用較大，患者往往難以接受。Allicin是一種百合科植物提取物，屬于三硫代烯丙醚類化合物[10]。目前的研究表明Allicin的藥用價(jià)值極高，可能在自身免疫性疾病、腫瘤、炎癥、感染性疾病等的治療中具有應(yīng)用價(jià)值[11,12]。

我們的研究顯示，經(jīng)過2周Allicin治療后，Allicin組小鼠疾病活動(dòng)度評(píng)分顯著降低，病理學(xué)證實(shí)小鼠腸道炎癥顯著改善。這提示Allicin對(duì)DSS小鼠具有確定的治療作用。腸上皮細(xì)胞凋亡是腸屏障破壞的重要表現(xiàn)形式，而腸屏障功能受損是UC的主要發(fā)病機(jī)制之一[13,14]。因而我們采用TUNEL法檢測(cè)了小鼠腸上皮細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Allicin可顯著改善由DSS引發(fā)的腸上皮細(xì)胞凋亡。這可能與Allicin的抗炎作用有關(guān)，因而我們檢測(cè)了小鼠腸黏膜炎癥因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Allicin顯著降低了包括IL-6、IL-1β及TNF-α的水平。這提示Allicin在體可發(fā)揮抗炎功能。JAK2/STAT3信號(hào)通路參與炎癥級(jí)聯(lián)放大過程，且可被IL-6激活[15]。因而，我們分析并發(fā)現(xiàn)Allicin可抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路。這可能是Allicin發(fā)揮抗炎作用的另一機(jī)制，但仍需進(jìn)一步研究以明確。

綜上所述，我們的研究證實(shí)Allicin對(duì)DSS小鼠腸炎具有治療作用，可能的機(jī)制包括抗炎、抑制上皮凋亡及抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路等。

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[收稿2016-01-06修回2016-03-07]

(編輯倪鵬)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.024

作者簡(jiǎn)介：陳晶(1970年-)，女，碩士，副主任技師，主要從事臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)及生物技術(shù)方面研究。

通訊作者及指導(dǎo)教師：王縛鯤(1970年-)，男，主任醫(yī)師，主要從事感染免疫方面研究。

中圖分類號(hào)R574.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)07-1039-04

Therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms

CHEN Jing,LI Qiao-Xia,LI Wei,LI Hong,TANG Fei,WANG Fu-Kun.Department of Clinical Laboratory,Bethune International Peace Hospital of PLA,Shijiazhuang 050082,China

[Abstract]Objective:To analyze the therapeutical effect of Allicin for colitis mice induced by DSS and its possible mechanisms.Methods: A total of 24 male mice were randomly divided into Control group,DSS group(2.5% DSS,7 days) and Allicin group [DSS treatment and Allicin，10 mg/(kg·d),7 d].Disease activity index,inflammatory score,TUNEL and Western bolt were performed to analyze the effect of Allicin on colitis induced by DSS.Results: With DSS group,the Allicin group had lower disease activity score and inflammatory score(P<0.05).Allicin group had a lower number of intestinal epithelial cell apoptosis than that of DSS group,the difference was statistically significant(P<0.05).Western bolt analysis shown that Allicin treatment significantly depressed the expression of p-JAK2 and p-STAT3 in intestinal mucosa when compared with these of DSS group(P<0.05).Conclusion: Conclusion Allicin has significantly therapeutic effect on mice colitis induced by DSS,the possible mechanisms including anti-inflammatory effects,protected of the intestinal epithelial cells and inhibition of the JAK2/STAT3 signaling pathways.

[Key words]Allicin；Animal model；Ulcerative colitis；Apoptosis；Inflammation

①河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊050011。