任　蕾　徐亞沛　秦貴軍　劉　聰　王守俊　孫良閣

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,鄭州450002)

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地塞米松對小鼠甲狀腺濾泡細胞增殖和凋亡的影響及其相關(guān)機制

任蕾徐亞沛①秦貴軍劉聰②王守俊孫良閣

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科,鄭州450002)

[摘要]目的：探討地塞米松對小鼠甲狀腺濾泡細胞的增殖及凋亡的影響。方法：取BALB/c小鼠甲狀腺組織，以胰酶+Ⅱ膠原酶聯(lián)合消化組織獲得甲狀腺濾泡細胞，并以甲狀腺球蛋白表達與否判斷是否為目的細胞。隨后采用不同濃度地塞米松刺激目的細胞，并采用MTT、流式細胞術(shù)檢測細胞增殖抑制率、凋亡率并對相關(guān)凋亡基因表達情況進行分析。結(jié)果：胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶處理甲狀腺組織可獲得穩(wěn)定傳代的甲狀腺濾泡上皮細胞，且細胞穩(wěn)定表達甲狀腺球蛋白。同時，不同濃度地塞米松對細胞增殖抑制差異具有統(tǒng)計學意義(F=8.544,P<0.05),且抑制情況與藥物作用時間具有交互作用(F=4.532，P<0.05)；此外，不同的地塞米松濃度10-6、10-5、10-4mol/L下，細胞凋亡率分別為13.39%±0.79%、17.43%±1.38%、26.42%±1.74%，均與0 mol/L地塞米松細胞凋亡率4.51%±0.06%差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01)，而該差異趨勢在凋亡基因表達中仍表現(xiàn)出劑量依賴性。結(jié)論：地塞米松可有效抑制小鼠甲狀腺濾泡細胞增殖，并通過多種凋亡途徑促進細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]地塞米松；甲狀腺濾泡細胞；增殖；凋亡

地塞米松(Dexamethasone,DEX)是臨床上應用較為廣泛的一種糖皮質(zhì)激素藥物；且因其具有較強的免疫抑制及抗炎、抗過敏作用，從而在甲狀腺相關(guān)疾病以及其他自身免疫性疾病的治療中占有一席之地[1]。與此同時，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，對橋本甲狀腺功能減退癥患者采取局部注射DEX治療時，調(diào)節(jié)性T淋巴細胞數(shù)量將會受DEX給藥濃度變化而產(chǎn)生變化，而該細胞凋亡或增殖，又可在一定程度上影響局部免疫功能及最終治療效果[2]。此外，DEX在促細胞凋亡方面的報道也屢見不鮮,如促進胰腺腺泡細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞的凋亡[3，4]，但是DEX在治療甲狀腺相關(guān)疾病中主要通過促進目的細胞凋亡還是通過調(diào)節(jié)其他免疫細胞發(fā)揮生理作用仍不得而知。而本研究旨在以小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞(Thyroid follicular epithelium cells,TFECs)為研究對象，通過比較不同DEX濃度下TFECs增殖及凋亡情況，從而為DEX在甲狀腺相關(guān)疾病中的應用提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物BALB/c小鼠，22～25 g，20只，雌雄各10只，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-009。

1.1.2主要試劑DEME(高糖)培養(yǎng)基、胎牛血清均購自GE公司，胰酶、地塞米松、Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司、小鼠抗甲狀腺球蛋白(thyrogloulin)I抗、HRP-標記羊抗鼠Ⅱ抗購自Abcam公司，實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(Recerse transcription-polymerase chain reaction,Real-time PCR)試劑盒購自TaKaRa公司，MTT試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.2方法

1.2.1小鼠甲狀腺濾泡原代細胞培養(yǎng)小鼠脊柱脫臼處死后，浸泡酒精10 s，并在無菌條件下分離小鼠甲狀腺組織。將分離組織剪成10～15小塊，約1 mm/塊，放入無菌的1.5 ml EP管中，用Dank′s液吹洗2～3次加入消化液(含0.25%胰酶，250 U/ml Ⅱ型膠原酶)，按頻率250次/min，37℃水浴振蕩90 min，離心1 000 r/min，3 min,棄上清，加入1 ml含10%FBS的DEME完全培養(yǎng)基重懸沉淀，將細胞懸液過200目篩后加入6孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)條件37℃ 5%CO2,次日觀察細胞生長情況，其中貼壁細胞為甲狀腺濾泡細胞，隨后根據(jù)細胞生長情況，進行換液及傳代。待細胞處于對數(shù)生長期時進行后續(xù)實驗。

1.2.2Western blot檢測收集培養(yǎng)48 h時以上且呈單層生長的TFECs，采用RIPA裂解液提取細胞內(nèi)蛋白，并以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)如下步驟進行Western blot檢測甲狀腺球蛋白：獲得目的蛋白并定量，進行PAGE-SDS電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉加入一抗(thyrogloulin)及二抗、顯影。

1.2.3抗增殖實驗將培養(yǎng)的單層TFECs消化后，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS)稀釋至細胞濃度約5×103個/ml，并按100 μl/孔接種于4塊96孔板中，每塊96孔板均1～2排添加50 μl/孔DEME完全培養(yǎng)基，3～4排、5～6排、7～8排分別加入10-6、10-5、10-4mol/L地塞米松50 μl/孔，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并于培養(yǎng)后12、24、48、72 h分別取一塊96孔板棄上清，每孔加入50 μl MTT，37℃條件下培養(yǎng)4 h，棄上清，加入DMSO(150 μl/孔)，振蕩5～10 min，酶標儀讀取待測物在波長490nm下吸光度值。

1.2.4地塞米松促凋亡實驗將培養(yǎng)的單層TFECs消化后，用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%FBS)稀釋至細胞濃度約2×106個/ml，1 ml/孔接種于6孔板中，并按0、10-6、10-5、10-4mol/L濃度添加地塞米松，每個樣品設(shè)置三個復孔，放于 37℃ 5% CO2培養(yǎng)48 h后，胰酶消化制成單細胞懸液。采用流式細胞儀測定各組細胞中所處細胞周期比例及凋亡情況。凋亡指數(shù)(%)=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.2.5凋亡相關(guān)基因檢測采用Real-time PCR法，步驟如下：胰酶消化獲得目的細胞，Trizol抽提獲得細胞總RNA，加入反轉(zhuǎn)錄酶獲得cDNA。檢測Bax、Bcl2、p53、Fas、caspase3及caspase9 mRNA轉(zhuǎn)錄情況。具體引物及內(nèi)參設(shè)計見表1。

表1引物及內(nèi)參設(shè)計

Tab.1Primer sequences and internal reference sequence

Sensechain(5'-3')Antisensechain(5'-3')BaxTCCACCAAGAAGCTGAGCGAGGTCCAGCCCATGATGGTTCTBcl2GGATTGTGGCCTTCTTTGAGCCAAACTGAGCAGAGTCTTCp53ATGAATTCGTTGGCTCGACTGTACCACCTGGAGTCTTCCAGTGTGATFasGATATGCTGTGGATCATGGCAACTTTTCGTTCACCAGcaspase3ACATGGCGTGTCATAAAATACCCACAAAGCGACTGGATGAACcaspase9ATGCTGTCCCATACCAGGCAGGAACCCCTTCTTGTGAPDHCGGAGTCAACGGATTTGGTCGTATAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC

2結(jié)果

2.1目的細胞獲取甲狀腺組織經(jīng)胰酶聯(lián)合 Ⅱ 型膠原酶法處理后，預第三日即可獲得大量TFECs，且細胞形態(tài)均一，均為貼壁生長、呈上皮樣或多角形，經(jīng)多次傳代處理后細胞形態(tài)無明顯變化。見圖1。

2.2Western blot檢測取TFECs原代細胞(P0)以及培養(yǎng)10代(P10)、培養(yǎng)20代細胞(P20)，并取三組細胞甲狀腺球蛋白表達量進行Western blot，且結(jié)果顯示三組蛋白表達量上無明顯差異。見圖2。

2.3MTT抗增殖結(jié)果由重復資料方差分析可知，不同的地塞米松濃度下，對TFECs增殖抑制程度具有一定差異，且組間比較存在統(tǒng)計學意義(F=8.544,P<0.05), 且不同濃度與不同培養(yǎng)時間存在交互作用(F=4.532，P<0.05)，見圖3。

圖1　小鼠甲狀腺濾泡上皮細胞Fig.1　Thyroid follicular epithelium cells

圖2　細胞甲狀腺球蛋白表達情況Fig.2　Expression of cell thyroglobulin

2.4流式細胞術(shù)檢測凋亡結(jié)果不同濃度地塞米松組細胞其細胞凋亡率與未添加地塞米松組細胞凋亡率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,P<0.05),且細胞凋亡率與地塞米松劑量增加成正相關(guān)，見表2。

2.5相關(guān)凋亡指標檢測如下表所示，所檢測的相關(guān)凋亡指標mRNA表達量變化趨勢均與DEX濃度具有劑量依賴性，除了Bcl2 mRNA量隨著DEX濃度增加而減少外，其余各指標mRNA均隨著DEX增加而增加，且均與未添加DEX(0 mol/L)組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。此外，Western blot結(jié)果進一步驗證以上結(jié)論。

圖3　不同濃度地塞米松對細胞增殖的影響Fig.3　Different concentrations of dexamethasone on cell proliferation

圖4　凋亡蛋白表達情況Fig.4　Apoptotic protein expression

表2TFECs流式細胞式結(jié)果

Tab.3TFECs flow type results

DexamethasoneconcentrationCellcycleG0/G1SG2/MApoptoticindex(%)0mol/L47.73±0.1431.27±0.1322.00±0.074.51±0.0610-6mol/L73.72±0.041)21.86±0.351)4.42±0.241)13.39±0.791)10-5mol/L82.35±0.351)2)12.90±0.281)2)5.75±0.831)2)17.43±1.381)2)10-4mol/L87.88±0.421)2)6.61±0.311)2)6.51±0.451)2)26.42±1.741)2)

Note：Compared with 0 mol/L，1)P<0.05;2)P<0.01.

表3各凋亡指標mRNA表達情況

Tab.3Each mRNA expression of apoptotic index

Groups0mol/L10-6mol/L10-5mol/L10-4mol/LBax1.001.22±0.231)1.34±0.241)1.48±0.351)Bcl21.000.87±0.191)0.63±0.281)0.34±0.121)p531.001.89±0.291)2.67±0.311)3.28±0.391)Fas1.001.28±0.211)2.23±0.241)3.29±0.251)caspase31.001.63±0.391)1.78±0.351)1.94±0.261)caspase91.001.68±0.171)2.26±0.241)3.25±0.291)

Note：Compared with 0 mol/L，1)P<0.05.

3討論

研究表明，細胞凋亡異常是橋本式甲狀腺炎等甲狀腺自身免疫性相關(guān)疾病發(fā)生的主要因素之一[5]。而DEX因具有明顯的促凋亡及抑制細胞增殖作用，已被作為常用細胞凋亡誘導劑用于各種腫瘤治療中[6]。因此，近年來對于DEX在甲狀腺相關(guān)疾病中的應用效果報道屢見不鮮。如其在甲狀腺濾泡癌及橋本甲狀腺功能減退癥中均具有較好療效[2]。然而，由于目前對甲狀腺自身免疫性相關(guān)疾病的發(fā)病機理尚不清楚，同時DEX具有較強的免疫抑制及抗炎、抗過敏等功效，因此探討DEX具體的作用機制對于疾病治療及發(fā)病機制研究具有一定臨床意義。然而，以往的研究多側(cè)重于DEX對疾病轉(zhuǎn)歸的影響，缺乏細胞水平的探討，此外，即使如何珂等[7]從細胞水平對藥物治療效果進行分析，但由于其并未對細胞進行必要的鑒定及是否具有傳代穩(wěn)定性進行研究，因此，對其所獲得結(jié)論的可靠性仍需進一步探討。

本研究采用雙酶聯(lián)合方法成功從甲狀腺組織中獲得甲狀腺濾泡上皮細胞，并采用顯微觀察及Western blot技術(shù)對多次傳代TFECs形態(tài)及其表達的甲狀腺球蛋白進行分析可知，20代次內(nèi)的TFECs仍保持較好在體狀態(tài)，且細胞蛋白表達無明顯差異，從而為保證體外結(jié)果與體內(nèi)結(jié)果的一致性提供可參考依據(jù)。而通過不同濃度梯度DEX藥物刺激TFECs可知，藥物在濃度為0～10-4mol/L之間時，其對細胞增殖的抑制作用具有明顯的劑量依賴性，且隨著藥物作用時間增加，其抑制作用更加明顯，而細胞凋亡情況可從另一方面解釋該現(xiàn)象。我們知道細胞周期G1/S期、G2/S期的轉(zhuǎn)換是細胞增殖周期的重要時刻，其中G1/S期主要是DNA合成，G2/S期主要為有絲分裂。而本研究中，隨著DEX濃度增加其細胞處于G0/G1期數(shù)量明顯增加，而處于S期的細胞比例則顯著降低，而該現(xiàn)象并不存在于G2/M期。由此我們推斷，G0/G1期是DEX抑制細胞增殖主要作用時相。而細胞增殖周期的不完全進行，往往可誘發(fā)細胞凋亡的發(fā)生。研究證實，細胞長時間處于某一時相時且DNA受損或未完全復制并最終導致無法修復時，細胞將啟動凋亡機制從而促進細胞凋亡[8]。因此,DEX濃度最高組10-4mol/L，其細胞凋亡率也最高26.42±1.74。

而為進一步研究DEX通過高表達哪些基因促發(fā)細胞凋亡，我們對Bax、Bcl2、p53、Fas、caspase3及caspase9 mRNA進行反轉(zhuǎn)錄，以便我們深入細胞凋亡發(fā)生具體原因。以往研究證實，Bax是促線粒體凋亡的重要基因，其可增加線粒體膜通透性，從而增加細胞色素C釋放量，并作用于凋亡效應因子從而誘導細胞凋亡[9]。而Bcl2基因具有抗凋亡作用，但給予不同濃度DEX后，細胞中Bcl2 mRNA表達量下降，同時，Bax mRNA表達量上升，而后者高表達往往是細胞凋亡的另一促發(fā)因素[10]。此外，F(xiàn)as作為研究較多的死亡基因，其通過與FasL結(jié)合，促發(fā)多種效應途徑誘導細胞凋亡[11]。另外，caspase9是細胞凋亡通路中的起始基因，而caspase3是細胞凋亡的執(zhí)行基因[12]，兩者在本研究中均出現(xiàn)劑量依賴性高表達，由此可見，DEX可作用于多個凋亡基因，從而確保細胞凋亡的順利進行。因此，更加確信了其在誘導細胞凋亡及抗增殖中的作用。

綜上所述，地塞米松濃度在0～10-4mol/L范圍時，其對于甲狀腺濾泡上皮細胞的增殖抑制作用及誘導凋亡的能力與藥物濃度具有劑量依賴性。然而，鑒于目前對于自身免疫性甲狀腺疾病發(fā)生機制尚不清楚，而細胞凋亡是否為疾病發(fā)展的主要因素仍需進一步研究。因此，后續(xù)有必要就甲狀腺濾泡上皮細胞相關(guān)性疾病或以細胞凋亡有關(guān)疾病深入研究，從而為更好的解釋疾病發(fā)生及藥物應用提供實驗依據(jù)。

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[收稿2015-10-29]

(編輯張曉舟)

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.07.007

作者簡介：任蕾(1983年-)，女，碩士，主要從事甲狀腺相關(guān)研究。

中圖分類號Q95.33

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)07-0965-05

Dexamethasone thyroid follicular cell proliferation and apoptosis in mice and its mechanisms

REN Lei，XU Ya-Pei,QIN Gui-Jun,LIU Cong,WANG Shou-Jun,SUN Liang-Ge.

Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou 450002,China

[Abstract]Objective:To discuss dexamethasone on proliferation of mouse thyroid follicular cells and apoptosis.Methods: Taken BALB/c mice thyroid tissue to trypsin+Ⅱ collagenase digestion organizations get thyroid follicular cells,and expression of thyroglobulin determined whether or not the target cell.Then different concentrations of dexamethasone to stimulate target cells,and the use of MTT,flow cytometry cell proliferation rate,apoptosis rate and the apoptosis-related gene expression analysis.Results: Trypsin joint type Ⅱ collagenase treatment of thyroid tissue to obtain a stable passage of thyroid follicular epithelial cells,and cells stably expressing thyroglobulin.At the same time,different concentrations of dexamethasone on cell proliferation difference was statistically significant (F=8.544,P<0.05),and the suppression of drug action have interaction (F =4.532,P<0.05);in addition,differently dexamethasone concentration 10-6mol/L,10-5mol/L,10-4mol/L,the apoptosis rates were 13.39%±0.79%,17.43%±1.38%,26.42%±1.74%,both with 0 mol/L to plug betamethasone 4.51%±0.06% apoptosis rate differences were statistically significant(P<0.05,P<0.01),while the difference in the expression of apoptotic genes trend still showed a dose-dependent manner.Conclusion: Dexamethasone can effectively inhibit thyroid follicular cell proliferation and induce apoptosis through a variety of apoptotic pathways.

[Key words]Dexamethasone;Thyroid follicular cells;Proliferation;Apoptosis

①鄭州市第三人民醫(yī)院，鄭州450000。

②中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110000。