趙繼明，彭健

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

MicroR N A-132在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義

趙繼明，彭健

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

目的探討M i croRNA-132（m i R-132）在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義。方法實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄定量PC R和原位雜交分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達(dá)情況。分析m i R-132表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)和預(yù)后之間的相關(guān)性。結(jié)果m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸黏膜組織（P＜0.01），m i R-132低表達(dá)與結(jié)腸癌分期更晚有關(guān)。多元回歸分析表明，m i R-132低表達(dá)與結(jié)腸癌患者生存期更短有關(guān)（P＜0.01），m i R-132是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。結(jié)論m i R-132表達(dá)下調(diào)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展，是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者預(yù)后的可靠指標(biāo)，m i R-132也具有成為結(jié)腸癌靶向治療靶點(diǎn)的潛力。

結(jié)腸癌；臨床病理參數(shù)；m i R-132家族；預(yù)后

結(jié)腸癌是全球常見的發(fā)病率和致死率都很高的惡性消化道腫瘤［1］。研究證明結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多階段、多因素參與的過程。結(jié)腸癌的發(fā)生與飲食、環(huán)境等因素密切相關(guān)，并且，結(jié)腸癌的發(fā)生涉及到遺傳突變，包括癌基因激活、抑癌基因失活、錯(cuò)配修復(fù)基因突變及基因過度表達(dá)等。

M i croRNAs（m i RNAs）是在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)的一類進(jìn)化上保守、單鏈小分子非編碼RNAs（17～25個(gè)核苷酸）。m i RNAs通過與其靶信使RNA轉(zhuǎn)錄子3'非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)［2］。m i RNA-132在肺癌［3］和胰腺內(nèi)分泌腫瘤［4］中表達(dá)降低，而在神經(jīng)膠質(zhì)瘤［5］和胃癌中［6］的表達(dá)升高。不同腫瘤中m i RNA表達(dá)水平不同，提示m i RNAs在腫瘤細(xì)胞中功能不同，且m i RNA調(diào)控其潛在靶基因的方式十分復(fù)雜。目前尚未見m i R-132在結(jié)腸癌中作用研究的報(bào)道，本研究主要分析m i R-132表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象

164例結(jié)腸癌組織標(biāo)本均為湘雅醫(yī)院2009年1 月-2012年12月結(jié)腸癌病例，均經(jīng)手術(shù)治療，手術(shù)前未經(jīng)放化療等其他治療，經(jīng)病理確診均為結(jié)腸癌，患者年齡28～64歲，中位年齡（49±2.4）歲。平均隨訪期為38.1個(gè)月（6～58個(gè)月）?；颊叨ㄆ诮邮苌眢w及超聲檢查，如有必要進(jìn)行CT掃描?？偵嫫谑侵甘中g(shù)至死亡間隔時(shí)間。

1.2主要試劑

RNA提取試劑盒和Taqm an m i RNA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Appl i ed Bi osyst em公司，DEPC購(gòu)自美國(guó)Si gm a公司，乙醇、氯仿和異丙醇均購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.3R N A提取及逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

應(yīng)用RNA提取試劑盒從結(jié)腸癌組織中提取RNA，采用Taqm an m i RNA試劑盒檢測(cè)成熟體m i RNA-132的表達(dá)水平。內(nèi)參校正：實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-t i m e reverse t ranscri pt i onquant i t at i vepol ym erasechai nrect i on，Real-t i m e RT-qPCR）。每個(gè)樣品加樣量約為10 ng，由于受到RNA濃度定量誤差和RNA逆轉(zhuǎn)錄效率誤差等的影響，每個(gè)樣品的等體積cDNA含量并不完全相同，為了校正此誤差，試驗(yàn)中以RNU6為內(nèi)參。采用二步法檢測(cè)m i RNA-93相對(duì)表達(dá)量。第1步，用莖環(huán)引物合成互補(bǔ)DNA。m i RNA逆轉(zhuǎn)錄采用10 ng總RNA 15μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，在PCR管中加入逆轉(zhuǎn)錄混合液7μl，濃度為2 ng/μl的總RNA 5μl，3μl特異性逆轉(zhuǎn)錄引物。輕輕混勻，在冰上放置5 m i n，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)16℃30 m i n，42℃保溫30 m i n，85℃保溫5 m i n，4℃保溫5 m i n。第2步，采用20μl反應(yīng)體系在ABI7300實(shí)時(shí)PCR儀中反應(yīng)，反應(yīng)體系為2×的Taq m an uni ve RsAl PCR通用混合液 10μl，20×的Taqm an m i RNA特異引物1μl，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4μl，加無RNA酶水5μl補(bǔ)充至體積20μl。循環(huán)條件為94℃預(yù)變性10 m i n，95℃變性15 s，60℃退火60 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)后觀察分析結(jié)果。所有的實(shí)時(shí)定量反應(yīng)包括無模板的對(duì)照反應(yīng)，均按ABI7300實(shí)時(shí)PCR儀說明書進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)中Ct檢測(cè)值在20～32之外的進(jìn)行第2次重復(fù)檢測(cè)。應(yīng)用公式2-Δct計(jì)算m i RNA-93的相對(duì)表達(dá)量。

1.4原位雜交檢測(cè)結(jié)腸癌組織中m i R-132l的表達(dá)

結(jié)腸癌組織標(biāo)本4 m m連續(xù)切片后，常規(guī)脫蠟脫水，H Cl于37℃反應(yīng)20 m i n增加組織通透性，4%多聚甲醛（0.1m ol/L PBS溶解）室溫條件下固定10 m i n，0.1 m ol/L TEA緩沖液Ⅰ［0.1 m ol/L三乙醇胺與乙酸酐混合液，濃度0.25%（體積比）］和TEA緩沖液Ⅱ［0.1 m ol/l，三乙醇胺與乙酸酐混合液，濃度0.5%（體積比）］雜交前處理以增加組織陽性雜交的強(qiáng)度。雜交：探針m i R-132用雜交液稀釋至20 nm ol，滴加于組織切片上，45℃水浴鍋內(nèi)雜交18 h。雜交后用TI-kS溶液沖洗3次，每次10m i n，封閉液封閉25m i n（封閉非特異的抗體結(jié)合位點(diǎn)）。雜交后采用Ant i-Di goxi geni n-POD檢測(cè)地高辛探針與m i RNA結(jié)合復(fù)合物，TSA放大系統(tǒng)增強(qiáng)原位雜交反應(yīng)的陽性信號(hào)，NBT/BCIP顯色，顯微鏡下控制顯色反應(yīng)，加核快紅復(fù)染3 m i n，中性樹膠封片。陽性對(duì)照和陰性對(duì)照：看家基因β-act i n的寡核苷酸探針做為每次雜交的陽性對(duì)照，不加探針的預(yù)雜交液做為每次實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。結(jié)果判斷：光學(xué)顯微鏡下對(duì)m i R-132在組織切片中每一組織點(diǎn)的表達(dá)進(jìn)行綜合觀察判斷。①根據(jù)陽性染色強(qiáng)度判斷：細(xì)胞無染色為0分；細(xì)胞呈淺藍(lán)色記1分；細(xì)胞染成藍(lán)色并無背景染色，為中等陽性，記2分；細(xì)胞暈紫色，無背景著色，為強(qiáng)陽性，記3分。②根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：無陽性細(xì)胞計(jì)0分；陽性細(xì)胞數(shù)≤30%計(jì)1分；30%～70%計(jì)2分；陽性細(xì)胞數(shù)＞70%計(jì)3分。取兩種計(jì)分結(jié)果的乘積，0分為陰性，1、2、3、4、6及9分為陽性。其中1、2分計(jì)作弱陽性（+），3、4分計(jì)作陽性（++），6分計(jì)作強(qiáng)陽性（+++），9分計(jì)作強(qiáng)陽性（++++）。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析，LSD檢驗(yàn)，比較m i R-132在結(jié)腸癌不同臨床分期和病理分級(jí)的中表達(dá)差異。癌組織和正常組織比較，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1m i R N A-132在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平

Real-t i m e R T-qPCR檢測(cè)結(jié)果表明，m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)（1.48±0.27）明顯低于正常結(jié)腸組織（4.64±1.21）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008）（見圖1A、B）。

本研究進(jìn)一步采用原位雜交分析方法驗(yàn)證了m i R-132在結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)類型和細(xì)胞定位情況。原位雜交分析結(jié)果表明m i R-132主要表達(dá)于細(xì)胞核，而在正常結(jié)腸組織中呈強(qiáng)陽性表達(dá)（見圖2A、B和C）。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達(dá)降低與正常結(jié)腸組織表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與Real-t i m e RT-qPCR結(jié)果一致，m i R-132在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯低于正常結(jié)腸組織。

2.2m i R-132在結(jié)腸癌中表達(dá)降低與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

將m i R-132原位雜交檢測(cè)的中位值3.74作為164例結(jié)腸癌患者的分組閾值，其中m i R-132低表達(dá)組104例，高表達(dá)組60例，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明m i R-132低表達(dá)組腫瘤與分期和分級(jí)相關(guān)（見表1）。m i R-132表達(dá)與結(jié)腸癌的其他病理特征無關(guān)，如患者年齡、組織類型、腫瘤直徑、化療藥物抗性和腫瘤復(fù)發(fā)等。

2.3結(jié)腸癌中m i R-132表達(dá)降低的預(yù)后價(jià)值

Kapl an-M ei er生存曲線分析表明，低表達(dá)m i R-132的結(jié)腸癌患者與總生存期相關(guān)（見圖3）。此外，多元回歸分析表明m i R-132低表達(dá)（H R 23.74，95%CI：1.58，52.66，P=0.000）、TNM分期（H R 19.94，95%CI：1.27，42.85，P=0.000）和腫瘤組織分級(jí)（H R 16.23，95%CI：1.05，39.28，P=0.008）與總生存期相關(guān)（見表2）。多元COX回歸分析進(jìn)一步校正其他預(yù)后因素，結(jié)果表明m i R-132是影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后因子（見表3）。

圖1　m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)差異

圖2　原位雜交檢測(cè)m i R-132在結(jié)腸癌和正常結(jié)腸組織中的表達(dá)差異

表1　m i R-132表達(dá)與結(jié)腸癌臨床特征的關(guān)系

圖3　結(jié)腸癌患者中m i R-132表達(dá)的生存曲線

表3　多元回歸分析結(jié)腸癌患者的預(yù)后因素

表2　結(jié)腸癌中m i R-132表達(dá)降低的預(yù)后價(jià)值

3　討論

結(jié)腸癌早期癥狀不明顯，且無特異性腫瘤標(biāo)志物，大多數(shù)結(jié)腸癌患者診斷時(shí)已處于進(jìn)展期，當(dāng)結(jié)腸癌患者接受治療后，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的主要因素，由此導(dǎo)致結(jié)腸癌患者預(yù)后較差。最新研究結(jié)果顯示，與正常神經(jīng)元和胃組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和胃癌組織中m i R-132表達(dá)上調(diào)［5-6］。此外，肺癌、膀胱癌、食管鱗癌、舌部鱗癌、子宮癌及睪丸癌等組織中亦有m i R-132表達(dá)下調(diào)，提示m i R-132作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。人們?cè)噲D探討m i R-132在結(jié)腸癌患者預(yù)后中的價(jià)值，但到目前還沒有發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的結(jié)論。本研究結(jié)果表明，m i R-132在結(jié)腸癌中表達(dá)明顯下降。此外，m i R-132表達(dá)降低還與結(jié)腸癌患者侵襲性臨床病理特征和預(yù)后差密切相關(guān)。Li u等［5］在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，m i R-132能夠作為胃癌患者預(yù)后因子。79例胃癌患者中，m i R-132在癌組織中的表達(dá)水平明顯高于相應(yīng)的正常組織。Set t y等在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，m i R-132在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)更高，且m i R-132過表達(dá)與患者預(yù)后差相關(guān)［6］。這兩項(xiàng)結(jié)果與本研究結(jié)果不一致，造成結(jié)果不一致的原因目前尚不清楚，可能是因腫瘤類型、標(biāo)本量大小及所采取的研究方法不同引起的。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)m i R-132表達(dá)在不同分期、分級(jí)結(jié)腸癌中存在明顯的差異表達(dá)，提示其表達(dá)的下調(diào)可能是結(jié)腸癌進(jìn)展過程中的重要步驟。國(guó)內(nèi)學(xué)者楊秀芳等［7］研究m i R-132/212家族在肺癌中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá)m i R-132能夠加快NSCLC細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出原癌基因的特征；而李書軍等［8］發(fā)現(xiàn)m i R-132在食管鱗癌中的表達(dá)明顯降低，與食管癌的臨床分期以及預(yù)后相關(guān)，m i R-132表達(dá)水平可作為食管癌臨床分期、分級(jí)和預(yù)后的潛在指標(biāo)。上述研究結(jié)果亦支持本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。根據(jù)以往研究結(jié)果m i R-132有可能發(fā)揮抑癌作用，也可能發(fā)揮促癌作用，具體發(fā)揮何種作用與腫瘤類型及腫瘤微環(huán)境有關(guān)。本研究結(jié)果表明，結(jié)腸癌組織中m i R-132呈低表達(dá)，且m i R-132低表達(dá)與分期更晚有關(guān)，提示m i R-132表達(dá)下調(diào)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)展，因此筆者認(rèn)為m i R-132在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用。

近來m i RNA家族被證實(shí)為腫瘤的有效標(biāo)志物，并且是腫瘤細(xì)胞上皮表型的決定性因素［9］。m i R-132已被證實(shí)在多種人類腫瘤中表達(dá)下調(diào)，被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲過程中EM T的負(fù)向調(diào)控因子。m i R-132也被認(rèn)為是增強(qiáng)結(jié)腸癌化療敏感性或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的新靶點(diǎn)［11］，而在一組卵巢腺癌細(xì)胞株內(nèi)或獲得性藥物抗性研究中發(fā)現(xiàn)m i R-132表達(dá)與紫杉醇和順鉑化療抗性有關(guān)。此外，還有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中m i R-132表達(dá)明顯發(fā)生變化，但是這些研究結(jié)果多有相互沖突之處。部分研究屬于m i RNA表達(dá)譜特征分析，由于分析時(shí)采用的芯片平臺(tái)不一樣，可能導(dǎo)致部分結(jié)果差異。相比之下，本研究采用 Real-t i m e RT-qPCR和原位雜交法分析m i R-132在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中m i R-132表達(dá)明顯下降，而在原位雜交中進(jìn)一步分析結(jié)腸癌組織中m i R-132的表達(dá)情況，結(jié)果亦表明m i R-132在結(jié)腸癌中的表達(dá)低于正常結(jié)腸組織。提示m i R-132在結(jié)腸癌組織中低表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)，m i R-132低表達(dá)組與分期和分級(jí)相關(guān)，提示m i R-132表達(dá)抑制與結(jié)腸癌惡性程度更高密切相關(guān)?？傊緦?shí)驗(yàn)結(jié)果中m i R-132過表達(dá)抑制腫瘤進(jìn)展，被認(rèn)為是預(yù)測(cè)結(jié)腸癌患者生存的可靠生物標(biāo)志物，m i R-132是進(jìn)展期結(jié)腸癌患者潛在的有效治療靶點(diǎn)。

［1］陳方軍，劉玉蘭，張育軍，等.結(jié)腸癌干細(xì)胞生物學(xué)特性研究進(jìn)展［J］.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，21（11）:23-27.

［2］Duf resne A，Pat urel M，Al bert i L，et al.Predi ct i on of desm oi d t um or progressi on usi ng m i RNAexpressi on prof i l i ng［J］.Cancer Sci ence，2015，106（5）:650-655.

［3］You J，Li Y，F(xiàn)ang N，et al.M i R-132 Suppresses t he m i grat i on and i nvasi on of l ung cancer cel l s vi a t arget i ng t he EM T regul at or ZEB2［J］.PLoS ONE，2014，DOI:10.1371/j ournal.pone.0091827.

［4］Park JK，H enry JC，Ji ang J，et al.m i R-132 and m i R-212 are i ncreased i n pancreat i c cancer and t arget t he ret i nobl ast om a t um or suppressor［J］.Bi ochem i cal and Bi ophysi cal Research Comm uni cat i ons，2011，406（4）:518-523.

［5］Li u X，Yu H，Cai H，et al.The expressi on and cl i ni cal si gni f icance of m i R-132 i n gast ri c cancer pat i ent s［J］.Di agn Pat hol，2014，9:57.

［6］Set t y M，H el m y K，Khan AA，et al.Inf erri ng t ranscri pt i onal and m i cro RNA-m edi at edregul at oryprogram si ngl i obl ast om a［J］. M ol ecul ar Syst em s Bi ol ogy，2012，8（9）:605-610.

［7］楊秀方，褚凱麗，李媛，等.m i R-132調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌hedgehog信號(hào)通路受體基因PTCH 1及細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2015，42（3）:291-299.

［8］李書軍，張秀金，侯俊峰，等.H sa-m i R-132通過靶向FOXA1基因影響食管癌細(xì)胞的增殖和侵襲［J］.中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2011，18（5）:485-489.

［9］李海明，施南峰.m i RNA——一種新的調(diào)控基因表達(dá)的小分子RNA［J］.中國(guó)癌癥雜志，2006，16（8）:5397-5404.

［10］Anand S，M aj et i BK，Acevedo LM，et al.M i croRNA-132-m ediat ed l oss of p120RasGAP act i vat es t he endot hel i umt o f aci l i t at e pat hol ogi cal angi ogenesi s［J］.Nat ure M edi ci ne，2010，16（8）:909-914.

［11］Li u Q，Li ao F，W u H，et al.Upregul at i on of m i R-132 expressi on i n gl i om a and i t s cl i ni cal si gni f i cance［J］.Tum our Bi ol ogy t he Journal of t he Int ernat i onal Soci et y f or Oncodevel opm ent al Bi ol ogy&M edi ci ne，2014，13（4）:86-92.

（申海菊編輯）

Expression and roles of microRNA-132 in conlon carcinoma

Ji-ming Zhao，Jian Peng
（Xiangya Hospital，Central South University，Changsha，Hunan 410008，China）

Objective To investigate the association of miR-132 expression with clinicopathological characteristics and overall survival in patients with colon cancer.Methods Expression levels of the miR-132 were detected using qRT-PCR andin situhybridization.Associations of miR-132 expression with clinicopathological factors and overall survival were statistically evaluated.Results The expression levels of miR-132 in the colon cancer tissues were significantly lower than those in the normal colon tissues，in line with the findings ofin situhybridization（P＜0.01）.In addition，the tumors with low miR-132 expression were more likely to have advanced clinical stage（bothP=0.006）and higher grade（P=0.01 and 0.02）.Moreover，univariate analysis showed that the colon cancer patients with low miR-132 expression had shorter overall survival（P＜0.01）. Multivariate statistical analysis further identified miR-132 as an independent prognostic factor for colon cancer （P＜0.01）.Conclusions miR-132 low-expression may promote the aggressive tumor progression and be recognized as a reliable marker to predict the survival in patients with colon cancer.The three miRNAs could be attractive therapeutic targets in patients with advanced-stage colon cancer.

colon cancer；clinicopathology；miR-132；prognosis

R 735.35

A

1005-8982（2016）05-0048-05

10.3969/j.i s sn.1005-8982.2016.05.010

2015-08-28

彭健，Tel：13607441906，E-m ai l：158924615@qq.com