朱金照，黎環(huán)，呂勇，王艷麗，熊偉，劉曉燕，吳旭瑋

（福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院 肝病消化內科，福建 福州 350025）

伊托必利對肝衰竭大鼠胃腸道動力的影響*

朱金照，黎環(huán)，呂勇，王艷麗，熊偉，劉曉燕，吳旭瑋

（福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院 肝病消化內科，福建 福州 350025）

目的觀察伊托必利對肝衰竭大鼠胃腸道動力的影響，探討其可能的作用機制。方法60只Wistar大鼠隨機分為肝衰竭模型組（以下簡稱模型組）、肝衰竭模型+伊托必利治療組（以下簡稱治療組）和對照組，采用葡聚糖藍-2000為胃腸內標記物，測定大鼠胃腸道傳輸的改變，通過放射免疫和免疫組織化學法觀察大鼠胃竇、小腸組織中胃動素（MTL）的含量和分布變化。結果與對照組比較，模型組大鼠胃腸道動力明顯減弱（P＜0.01），胃竇、十二指腸組織中MTL的含量及分布無明顯減少（P＞0.05）；但伊托必利治療后，大鼠胃腸道傳輸明顯改善（P＜0.05），胃、十二指腸組織中MTL的含量和分布明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論伊托必利能明顯改善肝衰竭大鼠的胃腸道功能，其機制可能與MTL有關。

肝衰竭；胃腸動力；胃動素；伊托必利

伊托必利是臨床上常用的促胃腸動力藥物，研究發(fā)現其主要通過對多巴胺D2受體和乙酰膽堿酯酶的拮抗作用增加乙酰膽堿的釋放，通過膽堿能受體增強胃腸動力［1-3］，臨床常用于功能性消化不良的治療［4-5］。肝衰竭患者常伴有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴重消化道癥狀，該癥狀嚴重影響肝衰竭患者的生活質量［6］。目前，在治療肝衰竭胃腸動力障礙方面，安全、有效的藥物不多，伊托必利是一種安全有效的促胃腸動力藥物，因此本實驗通過建立肝衰竭大鼠模型，觀察伊托必利對肝衰竭大鼠胃腸道動力的影響，并初步探討其機制。

1　材料與方法

1.1實驗分組

選用清潔級Wistar大鼠（上海實驗動物中心提供）制作急性肝衰竭動物模型，雌雄各半，體重200～250 g。將60只Wistar大鼠隨機分為對照組、肝衰竭模型組（以下簡稱模型組）和肝衰竭模型+托必利治療組（以下簡稱治療組）各20只。模型組采用350 mg/kg硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）（天津科密歐化學試劑公司），腹腔注射，24 h后重復1次，自由飲水。治療組在給予大鼠TAA 24 h后，灌服5%伊托必利混懸液0.5 ml/100 g，2次/d，持續(xù)1周。用生理鹽水配成40 g/L TAA溶液備用，鹽酸伊托必利片（哈爾濱哈藥集團）制備成5%伊托必利混懸液4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2大鼠胃腸道動力測定

以2%葡聚糖藍-2000為胃腸內標記物，各組動物在開腹前20 min灌入0.5 ml 2%葡聚糖藍-2000，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，開腹留取標本。取全胃腸道，量取胃腸道色素最前端及全小腸的長度，以兩者的比值為胃腸道推進百分率，測定胃腸道傳輸速率，代表胃腸道動力的改變。

1.3胃腸道組織勻漿胃動素放射免疫測定

胃動素（small intestine，MTL）放射免疫測試藥盒由解放軍總醫(yī)院東亞免疫研究所提供。大鼠麻醉后，分別取2.5 g胃竇、十二指腸組織，加入生理鹽水3 ml用粉碎機制成勻漿，4℃、3 500 r/min離心20 min，取上清液置入-30℃冰箱冷凍保存待測。MTL按放射免疫分析藥盒說明書進行操作。

1.4胃竇、十二指腸組織MTL免疫組織化學法染色

免疫組織化學試劑由江西生物技術公司提供，按鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法（strep tavidin-perosidase，SP）進行。分別將胃竇、十二指腸組織標本加入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PB）中固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋備用。將石蠟切片，60℃烤片4～6 h；組織于二甲苯及酒精中脫蠟，自來水沖洗；3%雙氧水H2O2室溫下孵育10 min，以消除內源性過氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡5 min；5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；傾去多余血清，分別滴加兔抗鼠1∶50 MTL 4℃過夜；PBS漂洗5 min×3次；滴加1∶100生物素標記二抗50μl，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；滴加1∶100辣根酶標記鏈霉孵白素50μl，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；加入新配制的二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，3～5 min后光鏡下觀察結果。自來水沖洗、復染、脫水、封片。

1.5圖像分析

采用Backmen全自動圖像分析系統(tǒng)。取胃竇、十二指腸組織免疫組織化學法切片，每張切片于200倍光鏡下選取5個視野，觀察MTL的染色及分布，將圖像掃描入計算機，通過計算機自動分析得到相應的數據。

1.6統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1肝衰竭模型的制作

采用硫代乙酰胺制作急性肝衰竭模型，成功率高，重復性好，20只模型組大鼠，第2次注射后24 h內死亡3只，20只治療組大鼠第2次注射后24 h內死亡2只，其余觀察至72 h。肝衰竭模型出現明顯癥狀，包括嗜睡、反應遲鈍、食量少、腹脹等，肝臟病理檢查顯示，肉眼肝充血腫大，肝臟包膜表面可見點狀出血，光鏡下肝組織結構破壞，小葉紊亂，肝細胞明顯水腫，呈氣球樣變，匯管區(qū)炎癥細胞浸潤，可見肝細胞點片狀、灶狀壞死。

2.2胃腸道動力的測定

與對照組比較，模型組大鼠胃腸推進比下降，胃腸道動力受損，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.970，P= 0.000）。治療組經伊托必利治療后，與模型組比較，肝衰竭大鼠胃腸推進比好轉，差異有統(tǒng)計學意義（t= 4.870，P=0.000），而與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.968，P=0.339），說明伊托必利治療后肝衰竭大鼠胃腸道動力明顯恢復。見表1。

2.3胃、十二指腸組織MTL含量的變化

模型組胃、十二指腸組織中MTL的含量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.220和0.089，P=0.828和0.929）；伊托必利治療1周后，肝衰竭大鼠胃、十二指腸組織中MTL含量增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=1.696和1.657，P=0.028和0.037）。見表2。

表1　大鼠胃腸道動力的變化

表2　大鼠胃、十二指腸組織MTL含量的變化 （±s）

表2　大鼠胃、十二指腸組織MTL含量的變化 （±s）

注：?與模型組比較，P＜0.05

組別十二指腸組織對照組（n=20）　107.53±62.32　214.42±80.12模型組（n=17）　103.25±55.01　211.89±92.34治療組（n=18）　138.51±72.35?　265.52±98.71?胃組織

2.4胃、十二指腸組織MTL分布的變化

對照組與模型組大鼠胃、十二指腸組織中MTL著色淺，分布較稀少，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義（t=0.366和0.981，P=0.718和0.334）；經伊托必利治療1周后，肝衰竭大鼠胃、十二指腸組織中MTL著色變深，分布增多，與治療前模型組比較，MTL明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.701和5.070，P=0.017 和0.000）（見表3）。對照組大鼠胃竇MTL免疫陽性物質表達較低，分布少，染色較淺（見圖1）；模型組大鼠胃竇MTL免疫陽性物質表達較低，染色淺，分布

表3　大鼠胃、十二指腸組織MTL分布的變化 （±s）

表3　大鼠胃、十二指腸組織MTL分布的變化 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

組別十二指腸對照組（n=20）　18.32±6.14　25.23±6.24模型組（n=17）　19.01±5.17　27.18±5.76治療組（n=18）　26.23±6.281）　41.83±10.512）胃竇

圖1　對照組大鼠胃竇MTL免疫組織化學法染色 （×200）

稀少（見圖2）；治療組大鼠胃竇MTL免疫陽性物質分布更豐富，著色明顯（見圖3）；對照組大鼠十二指腸MTL免疫陽性物質染色較淺，分布少（見圖4）；模型組大鼠十二指腸MTL免疫陽性物質表達低，染色淺，分布少（見圖5）；治療組大鼠十二指腸MTL免疫陽性物質分布較豐富，染色明顯加深（見圖6）。

圖2　模型組大鼠胃竇MTL免疫組織化學法染色 （×200）

圖3　治療組大鼠胃竇MTL免疫組織化學法染色 （×200）

圖4　對照組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學法染色（×200）

圖5　模型組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學法染色（×200）

圖6　治療組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學法染色（×200）

3　討論

肝衰竭患者死亡率較高，與其常伴有胃腸功能障礙甚至胃腸功能衰竭密切相關。因此，研究肝衰竭胃腸動力障礙的藥物干預并探討其機制，對提高肝衰竭的治療成功率有較大的臨床意義。

伊托必利是目前臨床上應用較多且副作用較小、安全度較高的新一代胃腸促動力藥［7-8］。胃動素是1966年被發(fā)現的，由22個氨基酸組成的直鏈多肽，由內分泌Mo細胞分泌，可在消化間期呈周期性釋放，促進胃腸運動并刺激胃蛋白酶的分泌，并證實MTL對胃腸道移行復合運動起非常重要的調節(jié)作用［9-11］。

本實驗發(fā)現，肝衰竭大鼠胃腸動力明顯減退，與對照組比較，胃、十二指腸組織中MTL的含量無明顯變化，胃腸組織中MTL的分布也無明顯改變。但應用伊托必利后，大鼠胃腸動力障礙明顯改善，同時胃、十二指腸組織中MTL的含量明顯升高，胃腸組織中MTL的分布也顯著增加，說明伊托必利能顯著改善肝衰竭大鼠的胃腸動力，其機制可能與促進胃腸道胃動素的釋放有關，但是否還涉及其他方面的機制還需深入研究。

［1］JARVIEE M，CELLEKS，SANGERGJ.Potentiationby cholinesteraseinhibitorsofcholinergicactivityinratisolated stomach and colon［J］.Pharmacol Res，2008，58（5/6）：297-301.

［2］SCARPELLINI E，VOS R，BLONDEAU K，et al.The effects of itopride on oesophageal motility and lower oesophageal sphincter function in man［J］.Aliment Pharmacol Ther，2011，33（1）：99-105.

［3］李富軍，鄒益友，黃田輝.促胃腸動力藥對大鼠胃及十二指腸電活動的影響［J］.中南大學學報（醫(yī)學版），2009，34（7）：599-602.

［4］范紅云，段志英，朱秀芳，等.鹽酸伊托必利治療功能性消化不良的臨床療效觀察［J］.臨床薈萃，2013，28（5）：565-566.

［5］馬曉光，高保華，吳方雄，等.質子泵抑制劑聯合依托必利對胃食管反流病的療效評價［J］.胃腸病學和肝病學雜志，2013，22（11）：1110-1113.

［6］王宇明，李蘭娟.肝衰竭診治指南（2012年版）治療進展解讀與探討［J］.中華臨床感染病雜志，2013，6（2）：77-80.

［7］杜愛民，楊霞，毛勇，等.胃腸道動力藥聯用黛力新治療功能性消化不良的對比研究［J］.臨床消化病雜志，2013，3：138-140.

［8］王忠波，李丹.伊托必利在功能性消化不良治療中的應用［J］.中國藥師，2010，4（10）：559.

［9］SANGER G J，WANG Y，HOBSON A，et al.Motilin：towards a new understanding of the gastrointestinal neuropharmacology and therapeutic use of motilin receptor agonists［J］.Br J Pharmacol，2013，170（7）：1323-1332.

［10］譚康聯，陳志強.胃動素用于胃腸功能評價的研究進展［J］.世界華人消化雜志，2011，19（2）：156-160.

［11］SUZUKI A，ISHIDA Y，AIZAWA S，et al.Molecular identification of GHS-R and GPR38 in suncus murinus［J］.Peptides，2012，36（1）：29-38.

（童穎丹 編輯）

Itopride effect on gastrointestinal motility in rats with hepatic failure*

Jin-zhao Zhu，Huan Li，Yong Lyu，Yan-li Wang，Wei Xiong，Xiao-yan Liu，Xu-wei Wu
（Department of Liver and Digestive Diseases，Meng Chao Hepatobiliary Hospital，Fujian Medical University，Fuzhou，Fujian 350025，China）

Objective To observe the effect of Itopride on gastrointestinal motility in rats with hepatic failure，and to explore its possible mechanism.Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into hepatic failure model group（model group），the hepatic failure model+Itopride therapy group（treatment group）and normal control group.Blue dextran-2000 was used as the gastrointestinal marker.Gastrointestinal transit in rats was determined.Radioimmunoassay and immunohistochemistry method were used to observe the changes of content and distribution of motilin（MTL）in gastric antrum and small intestine of the rats.Results Compared with the control group，the gastrointestinal motility of the rats in the model group significantly decreased（P＜0.01），the content and distribution of MTL in the gastric antrum and duodenum tissue did not significantly decreased（P＞0.05）.However，after Itopride treatment，gastrointestinal transmission was significantly improved in the rats（P＜0.05），the content and distribution of MTL increased significantly in the tissues of stomach and duodenum，there were significant differences compared with the model group（P＜0.05）.Conclusions Itopride hydrochloride can significantly improve gastrointestinal function of the rats with hepatic failure，and its mechanism may be related to MTL.

liver failure；gastrointestinal motility；motilin；Itopride

R575.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.003

1005-8982（2016）09-0012-04

2014-11-25
*

福州市科技局科技計劃項目（No：2011-S-69-3）