朱金照，黎環(huán)，呂勇，王艷麗，熊偉，劉曉燕，吳旭瑋

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 肝病消化內(nèi)科，福建 福州 350025）

伊托必利對(duì)肝衰竭大鼠胃腸道動(dòng)力的影響*

朱金照，黎環(huán)，呂勇，王艷麗，熊偉，劉曉燕，吳旭瑋

（福建醫(yī)科大學(xué)孟超肝膽醫(yī)院 肝病消化內(nèi)科，福建 福州 350025）

目的觀察伊托必利對(duì)肝衰竭大鼠胃腸道動(dòng)力的影響，探討其可能的作用機(jī)制。方法60只Wistar大鼠隨機(jī)分為肝衰竭模型組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型組）、肝衰竭模型+伊托必利治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)治療組）和對(duì)照組，采用葡聚糖藍(lán)-2000為胃腸內(nèi)標(biāo)記物，測(cè)定大鼠胃腸道傳輸?shù)母淖?，通過(guò)放射免疫和免疫組織化學(xué)法觀察大鼠胃竇、小腸組織中胃動(dòng)素（MTL）的含量和分布變化。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃腸道動(dòng)力明顯減弱（P＜0.01），胃竇、十二指腸組織中MTL的含量及分布無(wú)明顯減少（P＞0.05）；但伊托必利治療后，大鼠胃腸道傳輸明顯改善（P＜0.05），胃、十二指腸組織中MTL的含量和分布明顯升高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論伊托必利能明顯改善肝衰竭大鼠的胃腸道功能，其機(jī)制可能與MTL有關(guān)。

肝衰竭；胃腸動(dòng)力；胃動(dòng)素；伊托必利

伊托必利是臨床上常用的促胃腸動(dòng)力藥物，研究發(fā)現(xiàn)其主要通過(guò)對(duì)多巴胺D2受體和乙酰膽堿酯酶的拮抗作用增加乙酰膽堿的釋放，通過(guò)膽堿能受體增強(qiáng)胃腸動(dòng)力［1-3］，臨床常用于功能性消化不良的治療［4-5］。肝衰竭患者常伴有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴(yán)重消化道癥狀，該癥狀嚴(yán)重影響肝衰竭患者的生活質(zhì)量［6］。目前，在治療肝衰竭胃腸動(dòng)力障礙方面，安全、有效的藥物不多，伊托必利是一種安全有效的促胃腸動(dòng)力藥物，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立肝衰竭大鼠模型，觀察伊托必利對(duì)肝衰竭大鼠胃腸道動(dòng)力的影響，并初步探討其機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組

選用清潔級(jí)Wistar大鼠（上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）制作急性肝衰竭動(dòng)物模型，雌雄各半，體重200～250 g。將60只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、肝衰竭模型組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)模型組）和肝衰竭模型+托必利治療組（以下簡(jiǎn)稱(chēng)治療組）各20只。模型組采用350 mg/kg硫代乙酰胺（Thioacetamide，TAA）（天津科密歐化學(xué)試劑公司），腹腔注射，24 h后重復(fù)1次，自由飲水。治療組在給予大鼠TAA 24 h后，灌服5%伊托必利混懸液0.5 ml/100 g，2次/d，持續(xù)1周。用生理鹽水配成40 g/L TAA溶液備用，鹽酸伊托必利片（哈爾濱哈藥集團(tuán)）制備成5%伊托必利混懸液4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2大鼠胃腸道動(dòng)力測(cè)定

以2%葡聚糖藍(lán)-2000為胃腸內(nèi)標(biāo)記物，各組動(dòng)物在開(kāi)腹前20 min灌入0.5 ml 2%葡聚糖藍(lán)-2000，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉，開(kāi)腹留取標(biāo)本。取全胃腸道，量取胃腸道色素最前端及全小腸的長(zhǎng)度，以兩者的比值為胃腸道推進(jìn)百分率，測(cè)定胃腸道傳輸速率，代表胃腸道動(dòng)力的改變。

1.3胃腸道組織勻漿胃動(dòng)素放射免疫測(cè)定

胃動(dòng)素（small intestine，MTL）放射免疫測(cè)試藥盒由解放軍總醫(yī)院東亞免疫研究所提供。大鼠麻醉后，分別取2.5 g胃竇、十二指腸組織，加入生理鹽水3 ml用粉碎機(jī)制成勻漿，4℃、3 500 r/min離心20 min，取上清液置入-30℃冰箱冷凍保存待測(cè)。MTL按放射免疫分析藥盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4胃竇、十二指腸組織MTL免疫組織化學(xué)法染色

免疫組織化學(xué)試劑由江西生物技術(shù)公司提供，按鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法（strep tavidin-perosidase，SP）進(jìn)行。分別將胃竇、十二指腸組織標(biāo)本加入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PB）中固定24 h，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋備用。將石蠟切片，60℃烤片4～6 h；組織于二甲苯及酒精中脫蠟，自來(lái)水沖洗；3%雙氧水H2O2室溫下孵育10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；蒸餾水沖洗，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）浸泡5 min；5%正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min；傾去多余血清，分別滴加兔抗鼠1∶50 MTL 4℃過(guò)夜；PBS漂洗5 min×3次；滴加1∶100生物素標(biāo)記二抗50μl，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；滴加1∶100辣根酶標(biāo)記鏈霉孵白素50μl，37℃孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次；加入新配制的二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色，3～5 min后光鏡下觀察結(jié)果。自來(lái)水沖洗、復(fù)染、脫水、封片。

1.5圖像分析

采用Backmen全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)。取胃竇、十二指腸組織免疫組織化學(xué)法切片，每張切片于200倍光鏡下選取5個(gè)視野，觀察MTL的染色及分布，將圖像掃描入計(jì)算機(jī)，通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)分析得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肝衰竭模型的制作

采用硫代乙酰胺制作急性肝衰竭模型，成功率高，重復(fù)性好，20只模型組大鼠，第2次注射后24 h內(nèi)死亡3只，20只治療組大鼠第2次注射后24 h內(nèi)死亡2只，其余觀察至72 h。肝衰竭模型出現(xiàn)明顯癥狀，包括嗜睡、反應(yīng)遲鈍、食量少、腹脹等，肝臟病理檢查顯示，肉眼肝充血腫大，肝臟包膜表面可見(jiàn)點(diǎn)狀出血，光鏡下肝組織結(jié)構(gòu)破壞，小葉紊亂，肝細(xì)胞明顯水腫，呈氣球樣變，匯管區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)片狀、灶狀壞死。

2.2胃腸道動(dòng)力的測(cè)定

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胃腸推進(jìn)比下降，胃腸道動(dòng)力受損，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.970，P= 0.000）。治療組經(jīng)伊托必利治療后，與模型組比較，肝衰竭大鼠胃腸推進(jìn)比好轉(zhuǎn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 4.870，P=0.000），而與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.968，P=0.339），說(shuō)明伊托必利治療后肝衰竭大鼠胃腸道動(dòng)力明顯恢復(fù)。見(jiàn)表1。

2.3胃、十二指腸組織MTL含量的變化

模型組胃、十二指腸組織中MTL的含量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.220和0.089，P=0.828和0.929）；伊托必利治療1周后，肝衰竭大鼠胃、十二指腸組織中MTL含量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.696和1.657，P=0.028和0.037）。見(jiàn)表2。

表1　大鼠胃腸道動(dòng)力的變化

表2　大鼠胃、十二指腸組織MTL含量的變化 （±s）

表2　大鼠胃、十二指腸組織MTL含量的變化 （±s）

注：?與模型組比較，P＜0.05

組別十二指腸組織對(duì)照組（n=20）　107.53±62.32　214.42±80.12模型組（n=17）　103.25±55.01　211.89±92.34治療組（n=18）　138.51±72.35?　265.52±98.71?胃組織

2.4胃、十二指腸組織MTL分布的變化

對(duì)照組與模型組大鼠胃、十二指腸組織中MTL著色淺，分布較稀少，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.366和0.981，P=0.718和0.334）；經(jīng)伊托必利治療1周后，肝衰竭大鼠胃、十二指腸組織中MTL著色變深，分布增多，與治療前模型組比較，MTL明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.701和5.070，P=0.017 和0.000）（見(jiàn)表3）。對(duì)照組大鼠胃竇MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)較低，分布少，染色較淺（見(jiàn)圖1）；模型組大鼠胃竇MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)較低，染色淺，分布

表3　大鼠胃、十二指腸組織MTL分布的變化 （±s）

表3　大鼠胃、十二指腸組織MTL分布的變化 （±s）

注：1）與模型組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.01

組別十二指腸對(duì)照組（n=20）　18.32±6.14　25.23±6.24模型組（n=17）　19.01±5.17　27.18±5.76治療組（n=18）　26.23±6.281）　41.83±10.512）胃竇

圖1　對(duì)照組大鼠胃竇MTL免疫組織化學(xué)法染色 （×200）

稀少（見(jiàn)圖2）；治療組大鼠胃竇MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布更豐富，著色明顯（見(jiàn)圖3）；對(duì)照組大鼠十二指腸MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)染色較淺，分布少（見(jiàn)圖4）；模型組大鼠十二指腸MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)表達(dá)低，染色淺，分布少（見(jiàn)圖5）；治療組大鼠十二指腸MTL免疫陽(yáng)性物質(zhì)分布較豐富，染色明顯加深（見(jiàn)圖6）。

圖2　模型組大鼠胃竇MTL免疫組織化學(xué)法染色 （×200）

圖3　治療組大鼠胃竇MTL免疫組織化學(xué)法染色 （×200）

圖4　對(duì)照組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學(xué)法染色（×200）

圖5　模型組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學(xué)法染色（×200）

圖6　治療組大鼠十二指腸MTL免疫組織化學(xué)法染色（×200）

3　討論

肝衰竭患者死亡率較高，與其常伴有胃腸功能障礙甚至胃腸功能衰竭密切相關(guān)。因此，研究肝衰竭胃腸動(dòng)力障礙的藥物干預(yù)并探討其機(jī)制，對(duì)提高肝衰竭的治療成功率有較大的臨床意義。

伊托必利是目前臨床上應(yīng)用較多且副作用較小、安全度較高的新一代胃腸促動(dòng)力藥［7-8］。胃動(dòng)素是1966年被發(fā)現(xiàn)的，由22個(gè)氨基酸組成的直鏈多肽，由內(nèi)分泌Mo細(xì)胞分泌，可在消化間期呈周期性釋放，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)并刺激胃蛋白酶的分泌，并證實(shí)MTL對(duì)胃腸道移行復(fù)合運(yùn)動(dòng)起非常重要的調(diào)節(jié)作用［9-11］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，肝衰竭大鼠胃腸動(dòng)力明顯減退，與對(duì)照組比較，胃、十二指腸組織中MTL的含量無(wú)明顯變化，胃腸組織中MTL的分布也無(wú)明顯改變。但應(yīng)用伊托必利后，大鼠胃腸動(dòng)力障礙明顯改善，同時(shí)胃、十二指腸組織中MTL的含量明顯升高，胃腸組織中MTL的分布也顯著增加，說(shuō)明伊托必利能顯著改善肝衰竭大鼠的胃腸動(dòng)力，其機(jī)制可能與促進(jìn)胃腸道胃動(dòng)素的釋放有關(guān)，但是否還涉及其他方面的機(jī)制還需深入研究。

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（童穎丹 編輯）

Itopride effect on gastrointestinal motility in rats with hepatic failure*

Jin-zhao Zhu，Huan Li，Yong Lyu，Yan-li Wang，Wei Xiong，Xiao-yan Liu，Xu-wei Wu
（Department of Liver and Digestive Diseases，Meng Chao Hepatobiliary Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350025，China）

Objective To observe the effect of Itopride on gastrointestinal motility in rats with hepatic failure，and to explore its possible mechanism.Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into hepatic failure model group（model group），the hepatic failure model+Itopride therapy group（treatment group）and normal control group.Blue dextran-2000 was used as the gastrointestinal marker.Gastrointestinal transit in rats was determined.Radioimmunoassay and immunohistochemistry method were used to observe the changes of content and distribution of motilin（MTL）in gastric antrum and small intestine of the rats.Results Compared with the control group，the gastrointestinal motility of the rats in the model group significantly decreased（P＜0.01），the content and distribution of MTL in the gastric antrum and duodenum tissue did not significantly decreased（P＞0.05）.However，after Itopride treatment，gastrointestinal transmission was significantly improved in the rats（P＜0.05），the content and distribution of MTL increased significantly in the tissues of stomach and duodenum，there were significant differences compared with the model group（P＜0.05）.Conclusions Itopride hydrochloride can significantly improve gastrointestinal function of the rats with hepatic failure，and its mechanism may be related to MTL.

liver failure；gastrointestinal motility；motilin；Itopride

R575.3

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.09.003

1005-8982（2016）09-0012-04

2014-11-25
*

福州市科技局科技計(jì)劃項(xiàng)目（No：2011-S-69-3）