于斐 曾暉 雷鳴 熊奡 肖德明 袁昊

北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科，深圳 518036

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis, OA) 是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘攸c，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解、軟骨細胞死亡和關(guān)節(jié)完整性破壞的慢性退行性病變，55歲以上人群的發(fā)病率為44%～70%[1]。目前，對于OA中軟骨退變的具體機制尚未完全闡明，而對其基因水平的研究近年來備受關(guān)注。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是一個含有高度保守催化核心序列的基因，依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，調(diào)控許多下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而起到抑制或激活下游基因、調(diào)節(jié)機體代謝、延長壽命和控制細胞分化、再生以及存活等多個方面的生物學(xué)效應(yīng)[2]。其可以通過抑制凋亡、調(diào)控新陳代謝、維持氧化應(yīng)力下線粒體的正常功能以及抑制炎癥等多個方面來調(diào)控細胞的衰老[3]。VEGF/AKT通路在生物體中起到重要作用，該通路可以通過血管異常生成加強炎癥的發(fā)生，并通過調(diào)節(jié)軟骨細胞的存活和凋亡影響OA中關(guān)節(jié)軟骨的退變過程。

本研究應(yīng)用Cre-Lox系統(tǒng)構(gòu)建軟骨特異性敲除SIRT1基因(SIRT1 cKO)小鼠，并通過單側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)建立OA模型，觀察SIRT1基因敲除后是否通過VEGF/AKT通路對OA關(guān)節(jié)軟骨退變產(chǎn)生影響，探討SIRT1基因通過VEGF/AKT通路調(diào)節(jié)OA關(guān)節(jié)軟骨退變的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：SIRT1co/co小鼠和Col2-CreERT2小鼠均購買自美國杰克遜實驗室。實驗用小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心深圳醫(yī)院實驗動物中心SPF級屏障區(qū)域的PVC鼠籠內(nèi)，持續(xù)過濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環(huán)。實驗流程和小鼠處理均遵循實驗動物管理規(guī)范條例。

1.1.2主要儀器：光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司)，高速冷凍離心機(德國SIGMA公司)，高壓滅菌器(日本Hirayama公司)，PCR熱循環(huán)儀(德國Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)Dolphin-DOC(美國Weahec公司)，ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，包埋切片機(日本Sakura公司)。

1.1.3主要試劑：VEGF、AKT、SIRT1一抗(Abcam公司),生物素化兔抗山羊IgG、SABC-POD、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，他莫昔芬、玉米油(Sigma公司)，鹽酸賽拉嗪注射液(吉林省敦化市圣達動物藥品有限公司)，TRE-trizol(Invitrogen公司)， PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa公司)，F(xiàn)ast Green Solution、Safranin O Solution(Scytek公司)。

1.2 方法

1.2.1軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的繁育：將Col2-CreERT2小鼠與SIRT1co/co小鼠交配，獲得Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠(SIRT1+/+小鼠)，15個月月齡Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠腹腔注射Tamoxifen(10mg/ml，1mg/ml·g體重，每日1次，連續(xù)注射5d),即獲得SIRT1 cKO小鼠(SIRT1-/-小鼠)。

1.2.2實驗分組及膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的建立：Tamoxifen注射完畢7 d后，SIRT1+/+小鼠和SIRT1-/-小鼠行右側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)建立OA模型，SIRT1+/+小鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)僅切開滑膜囊行假手術(shù)作為對照，手術(shù)后3個月建立膝關(guān)節(jié)OA模型。實驗樣本分為兩組：SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組(A組，n=6)：SIRT1基因未敲除，膝關(guān)節(jié)手術(shù)造成OA模型；SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組(B組，n=6)：SIRT1基因敲除，膝關(guān)節(jié)手術(shù)造成OA模型。模型建立后頸椎脫臼法處死小鼠，留取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)，10%福爾馬林固定后石蠟包埋。

1.2.3熒光定量PCR反應(yīng)鑒定軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的基因表型: 根據(jù)NCBI網(wǎng)站GeneBank查詢目的基因SIRT1序列，引物合成使用Primer Premier 5.0軟件，序列見表1。cDNA合成采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒。按照各目的基因退火溫度選擇三步法完成擴增，循環(huán)44次。根據(jù)熔解曲線判斷擴增產(chǎn)物的特異性，以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)參數(shù)參考TaKaRa SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time)試劑盒說明進行，運用Bio-Rad CFX96 Real Time PCR儀配套的Bio-Rad CFX Manager Software1.6數(shù)據(jù)分析軟件，采用2^-ΔΔCt法開展數(shù)據(jù)分析。

表1 熒光定量PCR反應(yīng)鑒定軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的引物Table 1 SIRT1 gene primers

1.2.4軟骨組織學(xué)檢測：組織標本修切后10%多聚甲醛固定24 h，脫鈣后石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚 5 um，行蘇木素-伊紅(HE)、番紅O-固綠雙染色。按照文獻[4]進行Mankin評分。

1.2.5免疫組化染色：烤片3 min；蒸餾水沖洗2次；抗原修復(fù)； PBS沖洗3次；滴加過氧化物酶阻斷劑；PBS液沖洗3次；滴加非免疫性動物血清；滴加SIRT1、VEGF和AKT-抗；PBS液沖洗3次；滴加生物素標記的二抗；滴加SP溶液；滴加2滴新鮮配制的DAB溶液。

1.2.6免疫組化結(jié)果觀察與判定：SIRT1、VEGF、AKT染色結(jié)果判定：經(jīng)DAB顯色，SIRT1、VEGF、AKT免疫組織化學(xué)以顯微鏡下染成棕黃色為陽性細胞；將染色強度分為4級：0級：陰性染色，1級：弱陽性染色，2級：中度陽性染色，3級：強陽性染色；再將每張切片中按所見陽性細胞范圍分為5級：0級：無陽性細胞，1級：陽性細胞占l%～20%，2級：陽性細胞占21%～50%，3級：陽性細胞占51%～75%，4級：陽性細胞占76%～100%；每張切片染色積分以兩者乘積表示。

2 結(jié)果

2.1 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的鑒定

剪取A組小鼠和B組小鼠胸骨處關(guān)節(jié)軟骨提取總RNA，并通過熒光定量 PCR反應(yīng)鑒定小鼠基因表型，結(jié)果顯示A組小鼠SIRT1 mRNA表達量為8.33467±1.800794，B組小鼠SIRT1 mRNA表達量為2.24417±1.316569，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖1)，證實SIRT1-/-小鼠關(guān)節(jié)軟骨中SIRT1基因敲除成功。

圖1 實驗中所用小鼠SIRT1表達趨勢及電泳圖Fig.1 The expression of SIRT1 and electrophoresis of SIRT1 in the mice used in the experiment.注：**P<0.01；Note：**P<0.01.

2.2 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)觀察

A組小鼠對照側(cè)軟骨組織層次清楚，關(guān)節(jié)表面軟骨平整，軟骨細胞正常，排列較整齊，分布均勻，染色均勻，番紅O染色正常，潮線完整無血管通過，Mankin評分為2.6667±0.51640分；A組小鼠骨關(guān)節(jié)炎造模側(cè)膝關(guān)節(jié)表面軟骨毀損，形態(tài)不規(guī)則，發(fā)生糜爛，軟骨變薄，軟骨細胞分布不均勻，成簇排列，番紅O染色不均勻，血管通過潮線，Mankin評分為7.3333±0.51640分，兩側(cè)Mankin評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，證實小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型建立成功。B組與A組相比膝關(guān)節(jié)表面軟骨毀損更嚴重，表面出現(xiàn)斷裂，甚至發(fā)生軟骨層缺失，軟骨細胞數(shù)量減少，番紅O失染，潮線前移且有血管通過，軟骨退變更嚴重，B組Mankin評分為9.8333±1.94079分，與A組相比Mankin評分差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2、3)。

圖2 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)表現(xiàn)：HE染色，番紅O固綠雙染色，×100。A與D：SIRT1+/+小鼠假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)表面軟骨情況；B與E：SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組膝關(guān)節(jié)表面軟骨情況；C與F：SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組膝關(guān)節(jié)表面軟骨情況。Fig.2 The histology of the knee joint cartilage: HE staining and Safranin O-Fast Green staining, ×100.A and D: SIRT1+/+ mice in OA group; B and E: SIRT1+/+ mice in OA group; C and F: SIRT1-/- mice in OA group.

圖3 SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組小鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分Fig.3 The Mankin’s score of SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.注：*P<0.05；Note:*P<0.05.

2.3 SIRT1、VEGF、AKT免疫組化染色

A、B兩組膝關(guān)節(jié)軟骨中SIRT1免疫組化染色積分分別為3.6667±1.21106、3.3333±1.96638；VEGF免疫組化染色積分分別為7.0000±1.54919、10.0000±2.44949；AKT免疫組化染色積分分別為3.1667±0.40825、1.3333±1.21106。SIRT1免疫組化結(jié)果中，B組與A組比較差異統(tǒng)計學(xué)意義不明顯(P>0.05)；VEGF免疫組化結(jié)果中，B組與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；AKT免疫組化結(jié)果中，B組與A組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖4、5)。

圖4 各組膝關(guān)節(jié)軟骨組織免疫組化，×400。A與B為SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組SIRT1表達情況；C與D為SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組VEGF表達情況；E與F為SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組AKT表達情況。Fig.4 The immunohistochemical images of the knee joint cartilage, ×400.A and B: The expression of SIRT1 in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group; C and D: The expression of VEGF in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group; E and F: The expression of AKT in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.

圖5 SIRT1+/+小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組和SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組兩組SIRT1、AKT、VEGF在膝關(guān)節(jié)軟骨中免疫組化染色積分。Fig.5 Immunohistochemical staining integral of SIRT1, AKT, and VEGF in the knee joint cartilage in SIRT1+/+ mice in OA group and SIRT1-/- mice in OA group.注：**P<0.01，*P<0.05；Note：**P<0.01,*P<0.05.

3 討論

OA以關(guān)節(jié)軟骨的退變磨損為主要特征，近年的研究表明長壽基因SIRT1在OA關(guān)節(jié)軟骨退變中起重要作用，該基因與衰老關(guān)系密切，是多種退行性病變發(fā)生的根源。

SIRT1基因可通過調(diào)節(jié)通路中蛋白的乙?；绊戃浌羌毎婊?，使軟骨區(qū)域糖蛋白減少，鈣元素沉積加速，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變[5]。OA發(fā)生時，軟骨細胞中SIRT1的表達水平明顯降低，抑制SIRT1表達可引起軟骨細胞凋亡[6]。而凋亡不僅加速成骨細胞和血管進入，還伴有鈣的積累和基質(zhì)鈣化,加速關(guān)節(jié)軟骨病理性退變。因此，SIRT1基因在OA關(guān)節(jié)軟骨的退變中起到重要作用。為了研究SIRT1基因的功能及作用機制，我們把軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠，和與其具有相同品系、月齡和飼養(yǎng)條件的SIRT1基因未敲除小鼠作對照，最大限度減少其他因素干擾。而Mankin評分是對OA評價的一種評分標準，分數(shù)越高，OA程度越嚴重，軟骨退變越明顯，結(jié)合該評分可以說明骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展程度。為了模擬OA的好發(fā)年齡，我們使用15月齡小鼠進行實驗[7]。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，Tamoxifen誘導(dǎo)后小鼠的軟骨組織中SIRT1基因敲除成功，當SIRT1基因敲除后，OA發(fā)生時小鼠的關(guān)節(jié)軟骨退變程度更嚴重，Mankin評分與SIRT1+/+小鼠OA模型組相比升高更明顯；SIRT1基因未敲除時，發(fā)生OA關(guān)節(jié)軟骨退變的一側(cè)膝關(guān)節(jié)中SIRT1的表達量顯著下調(diào)，Mankin評分與SIRT1+/+小鼠假手術(shù)側(cè)相比顯著升高。這說明SIRT1基因敲除可以加重OA關(guān)節(jié)軟骨的退變，并且實驗中骨關(guān)節(jié)炎小鼠模型建立成功，當OA發(fā)生時，關(guān)節(jié)軟骨中SIRT1表達水平明顯下調(diào)。

VEGF/AKT信號通路作為一個與血管生成密切相關(guān)的通路[8]，它在促進血管內(nèi)皮生成、完整性維持及內(nèi)皮細胞增殖分化方面起重要作用，同時它還可以影響細胞的衰老凋亡，對病理性退變產(chǎn)生作用。研究證實[9，10]，VEGF可以激活A(yù)KT，共同影響新生血管中內(nèi)皮細胞增值分化，加速新生血管的形成；激活內(nèi)皮細胞中SIRT1表達后可引起細胞中AKT表達上調(diào)，減輕內(nèi)皮細胞凋亡，血管生成速度減慢，并且用VEGF刺激時，血管內(nèi)皮細胞的生成又恢復(fù)正常，血管生成加速，SIRT1過表達后AKT的磷酸化水平升高，其通過下調(diào)氧化應(yīng)激抑制血管內(nèi)皮的衰老。

在OA中，VEGF/AKT通路通過血管異常生成加強炎癥發(fā)生，并通過調(diào)節(jié)軟骨細胞的存活影響關(guān)節(jié)軟骨退變。其中，VEGF誘導(dǎo)的血管生成分布在骨軟骨連接處，該處的血管生成與軟骨退化、疾病活動性相關(guān)[11]。在正常組織中，關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨交界處的血管生成和抗血管生成處于平衡狀態(tài)，而OA的滑膜炎癥刺激了血管生成，誘導(dǎo)軟骨發(fā)生退變，導(dǎo)致潮線前移、骨贅形成。隨著軟骨基質(zhì)被血管侵蝕，VEGF與AKT影響軟骨細胞導(dǎo)致鈣化層內(nèi)的細胞發(fā)生凋亡， 軟骨基底被新生的骨組織取代。當OA關(guān)節(jié)部位骨贅生成時，該區(qū)不僅出現(xiàn)VEGF的表達上調(diào)[12]而且在下調(diào)的AKT協(xié)同作用下出現(xiàn)軟骨細胞凋亡。也有研究表明[13，14]，在OA中，軟骨變性、軟骨基質(zhì)成分改變可引起VEGF和AKT作用，導(dǎo)致血管的生成，因炎癥致敏的神經(jīng)纖維又引起炎癥，進一步刺激血管生成；增多的VEGF也引起基質(zhì)金屬蛋白酶等因子升高，分解軟骨基質(zhì)，破壞軟骨組織，這些升高的因子又誘導(dǎo)VEGF的表達，形成惡性循環(huán)，加重OA的軟骨退變。而AKT是一個比較保守的基因，可以調(diào)節(jié)能量的代謝，與細胞的壽命相聯(lián)。該基因可能反式作用于VEGF的啟動子，促進VEGF的表達分泌[15]；AKT本身可以通過磷酸化下游基因促進軟骨細胞的存活,負向調(diào)控p53抑制軟骨細胞凋亡，并可以產(chǎn)生抗凋亡作用，AKT還可降低下游過氧化氫酶的表達，使細胞更易受到活性氧的影響發(fā)生衰老凋亡[16，17]。

那么在OA關(guān)節(jié)軟骨的退變中，SIRT1與VEGF/AKT通路是否存在著關(guān)聯(lián)？我們通過實驗發(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除與未敲除兩組小鼠中，當OA發(fā)生時VEGF和AKT的表達量均發(fā)生變化，其中VEGF發(fā)生上調(diào)，AKT發(fā)生下調(diào)。而當SIRT1基因敲除后，OA發(fā)生時VEGF的上調(diào)與AKT的下調(diào)比SIRT1基因未敲除時更為顯著。這可能是由于SIRT1基因敲除后VEGF/AKT通路被激活，上調(diào)的VEGF與下調(diào)的AKT協(xié)同作用引起鈣化區(qū)軟骨細胞向肥大表型分化進而促進軟骨細胞發(fā)生去分化和細胞凋亡[13,16]，而VEGF引起滑膜、關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨連接處異常血管生成并侵入凋亡細胞所在位置[11]，在引起神經(jīng)源性炎癥的同時導(dǎo)致軟骨基質(zhì)分解、軟骨基底發(fā)生骨化并被新生骨組織取代，潮線前移的同時引起骨贅生成，而骨贅區(qū)軟骨細胞也在VEGF和AKT的作用下出現(xiàn)凋亡[12,16]，進而軟骨組織發(fā)生病理性退變和鈣化，骨贅形成、軟骨基質(zhì)成分的改變、軟骨的退化又進一步導(dǎo)致VEGF分泌增加而AKT分泌減少，形成惡性循環(huán)，最終加重OA中軟骨組織退變。

OA中關(guān)節(jié)軟骨退變的具體機制至今尚未完全闡明，而特定基因如何通過信號通路影響關(guān)節(jié)軟骨的變化近年來備受關(guān)注。我們在建立膝關(guān)節(jié)OA的小鼠模型上闡明了SIRT1基因敲除可能通過激活VEGF/AKT這一通路加重OA關(guān)節(jié)軟骨的退化，因此SIRT1基因可能對骨關(guān)節(jié)炎起到保護作用，這對于研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制及治療措施具有一定的意義。