郭玉華，郁有祝，牛永生（安陽(yáng)工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，河南安陽(yáng)455000）

Fe3+對(duì)VB1與牛血清白蛋白相互作用的影響

郭玉華，郁有祝，牛永生
（安陽(yáng)工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，河南安陽(yáng)455000）

采用熒光光譜法考察Fe3+對(duì)VB1與牛血清白蛋白（BSA）相互作用的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，VB1對(duì)BSA的內(nèi)源性熒光有猝滅作用，猝滅類型為動(dòng)態(tài)猝滅，作用力類型為氫鍵和范德華力。Fe3+的加入并未改變VB1對(duì)BSA的猝滅類型和作用力類型，但對(duì)其猝滅速率常數(shù)（kq）、結(jié)合常數(shù)（KA）以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）會(huì)有不同程度的影響。同步熒光光譜顯示VB1主要與BSA中的色氨酸殘基作用，引起其構(gòu)象或周圍環(huán)境的改變。

VB1；牛血清白蛋白；Fe3+；熒光光譜

維生素B1（VB1）能夠構(gòu)成輔酶維持體內(nèi)的正常生理代謝，在臨床上主要用于防治腳氣病，輔助治療神經(jīng)炎、消化不良、全身感染、高熱、糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等各種疾?。?］。

血清白蛋白是血漿中含量最豐富的載體蛋白，在有機(jī)體內(nèi)起著儲(chǔ)存、轉(zhuǎn)化、運(yùn)輸?shù)戎匾砉δ?。人體中積累的金屬離子會(huì)與蛋白結(jié)合，影響藥物與蛋白的相互作用。因此本文在模擬人體生理pH條件下，選用與人血清白蛋白同源序列高度相似的牛血清白蛋白（BSA），利用熒光光譜法研究Fe3+對(duì)VB1與BSA相互作用的影響，為食品及藥物在體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝及新藥設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)、從分子水平上闡明藥物的作用機(jī)理提供參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑

日立F-7000熒光分光光度計(jì)：日立高新技術(shù)公司；pHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；CP214電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司。

VB1（天津光復(fù)精細(xì)化工研究所），配成濃度為1.0× 10-3mol/L溶液；牛血清白蛋白（BSA，Roche公司）用pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液（內(nèi)含0.05 mol/L NaCl）配制成1.0×10-4mol/L溶液；濃度為0.01 mol/L Fe（NO3）3溶液；其余試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2方法

在10 mL比色管中依次加入0.6 mL 1.0×10-4mol/L BSA溶液，1.0 mL pH=7.4 Tris-HCl緩沖溶液及不同體積1.0×10-3mol/LVB1溶液，定容。分別在288K和310K恒溫水浴中反應(yīng)5min。以280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，掃描290nm～450 nm的熒光光譜和再加入0.2 mL Fe3+溶液的熒光光譜。在298 K時(shí)測(cè)定VB1與BSA相互作用的同步熒光光譜和再加入0.2 mL Fe3+溶液的同步熒光光譜。

2　結(jié)果與討論

2.1VB1，VB1-Fe3+對(duì)BSA熒光光譜的影響

VB1，VB1-Fe3+對(duì)BSA熒光光譜的影響見(jiàn)圖1。

圖1　不同反應(yīng)體系的熒光發(fā)射光譜Fig.1　Emission spectra of BSA of different complex systems

由圖1可見(jiàn)：以280nm為激發(fā)波長(zhǎng)，BSA在343nm處有最大熒光發(fā)射峰。隨VB1及VB1-Fe3+的不斷加入，BSA的最大熒光發(fā)射峰位置不變，但其熒光發(fā)生了有規(guī)律的猝滅，說(shuō)明VB1及VB1-Fe3+與BSA之間發(fā)生了相互作用［2］。

2.2熒光猝滅類型和結(jié)合常數(shù)的確定

熒光猝滅過(guò)程常見(jiàn)的有靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅，猝滅機(jī)制可以通過(guò)Stern-Volmer方程［3］來(lái)研究：

式中：F0和F分別為猝滅劑不存在和存在時(shí)體系的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer猝滅常數(shù)；［Q］為猝滅劑的濃度；Kq為猝滅速率常數(shù)；τ0為無(wú)猝滅劑時(shí)熒光分子的平均壽命（生物大分子的熒光壽命大約為1× 10-8s［4］）。F0/F對(duì)［Q］作圖求出猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq，見(jiàn)表1。

表1　VB1，VB1-Fe3與BSA作用的猝滅參數(shù)Table 1　Quenching constants of VB1，VB1-Fe3to BSA

藥物與BSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)可由式（2）計(jì)算［5］：

式中：n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；KA為結(jié)合常數(shù)。

由表1可知，兩體系的熒光猝滅常數(shù)均隨溫度升高而增大，說(shuō)明VB1對(duì)BSA的猝滅為動(dòng)態(tài)猝滅［6］，F(xiàn)e3+會(huì)使Ksv、Kq增大，增強(qiáng)BSA的熒光猝滅，但不改變熒光猝滅類型。且加入Fe3+后，VB1與BSA之間的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)降低，說(shuō)明Fe3+使VB1與BSA之間的結(jié)合作用減弱，F(xiàn)e3+與VB1間存在競(jìng)爭(zhēng)作用［7］。競(jìng)爭(zhēng)作用存在的兩個(gè)可能原因：一是Fe3+與BSA結(jié)合改變了BSA的構(gòu)象或占據(jù)了VB1的結(jié)合位點(diǎn)；二是VB1會(huì)與Fe3+配位，影響其與BSA的結(jié)合。

2.3作用力類型的確定

藥物小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用力主要有氫鍵、靜電作用力、疏水作用和范德華力等。溫度變化范圍不大時(shí)，可認(rèn)為作用過(guò)程的ΔH為一定值。根據(jù)熱力學(xué)方程ln（K2/K1）=ΔH（1/T1-1/T2）/R和ΔG=-RTlnK =ΔH-TΔS，由表1結(jié)合常數(shù)KA數(shù)據(jù)，可計(jì)算出熱力學(xué)參數(shù)ΔH，ΔS，ΔG。根據(jù)Ross［8］理論，由表2知，ΔH＜0，ΔS＜0，可推斷VB1與BSA間的作用力主要為氫鍵和范德華力，加入Fe3+沒(méi)有改變兩者之間的作用力。同時(shí)，ΔH＜0說(shuō)明作用過(guò)程是放熱過(guò)程，溫度的升高不利于反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，所以結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)隨溫度升高而減小，與表1中數(shù)據(jù)一致。

表2　VB1，VB1-Fe3+與BSA作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 2　Thermodynamic constants of VB1，VB1-Fe3+to BSA

2.4同步熒光光譜

蛋白質(zhì)的熒光主要來(lái)自于色氨酸、酪氨酸，所以通過(guò)對(duì)色氨酸、酪氨酸同步熒光的測(cè)定，可以探討色氨酸或酪氨酸的構(gòu)象變化或周圍環(huán)境是否變化。Δλ= 15 nm和Δλ=60 nm時(shí)分別顯示的是酪氨酸和色氨酸殘基的熒光特征［9］。

有無(wú)Fe3+時(shí)，VB1與BSA作用的同步熒光光譜圖相似，見(jiàn)圖2。

圖2 反應(yīng)體系的同步熒光光譜Fig.2　Synchronous fluorescene spectra of complex system

由圖2可知，隨VB1濃度增大，酪氨酸和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度均逐漸降低，說(shuō)明有無(wú)Fe3+時(shí)，VB1與酪氨酸和色氨酸殘基均能發(fā)生作用，使其附近微環(huán)境改變［10］。但Δλ=60 nm條件下，熒光猝滅程度更明顯，推斷VB1與BSA結(jié)合的位置主要在色氨酸殘基［11］。

3　結(jié)論

利用熒光光譜法考察了Fe3+對(duì)VB1與BSA相互作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e3+的存在并未改變VB1對(duì)BSA的猝滅類型，但使猝滅常數(shù)增大，結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)減小。VB1與BSA的作用過(guò)程為自發(fā)過(guò)程，主要以氫鍵和范德華力為主，F(xiàn)e3+的加入沒(méi)有改變其作用力類型。同步熒光表明，VB1主要與色氨酸殘基結(jié)合?？傊?，F(xiàn)e3+影響VB1與BSA的結(jié)合，表現(xiàn)為與VB1存在競(jìng)爭(zhēng)作用?？梢?jiàn)，選擇合適的金屬離子，可以適當(dāng)?shù)母纳芕B1與BSA的作用，使其更好發(fā)揮功效，可為食品和藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供參考。

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Effect of Fe3+on the Interaction of VB1and Bovine Serum Albumin

GUO Yu-hua，YU You-zhu，NIU Yong-sheng
（College of Chemistry and Environmental Engineering，Anyang Institute of Technology，Anyang 455000，Henan，China）

The interactionofVB1and bovine serum albumin（BSA）was studied in the presence of Fe3+by fluorescence spectroscopy.The results indicated that VB1could quench the intrinsic fluorescence of BSA，the quenching mechanism was static quenching and the main binding force was hydrogen bond and Vander Waals.The fluorescence quenching mechanism and the main binding force were not changed in the presence of Fe3+，but the quenching rate constant（k）q，the binding constants（KA）and the binding sites（n）were changed in different degrees.Synchronous spectra showedthatVB1binded to tryptophan residue and changed its microenvironment.

VB1；bovine serum albumin；Fe3+；fluorescence spectroscopy

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.012

安陽(yáng)工學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（201318）

郭玉華（1979—），女（漢），副教授，碩士，主要從事藥物分析研究。

2015-04-10