吳芳，李開雄，李應(yīng)彪，陳帥，許程劍（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

響應(yīng)面法優(yōu)化葡萄籽蛋白質(zhì)提取工藝

吳芳，李開雄，李應(yīng)彪，陳帥，許程劍*
（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832000）

為了提高赤霞珠葡萄籽的有效利用率，采用堿溶酸沉法提取葡萄籽中的蛋白質(zhì)，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Central Composite中心組合設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert.8.05數(shù)據(jù)分析軟件，對蛋白質(zhì)提取進(jìn)行四因素三水平的優(yōu)化分析。確立最佳提取條件：NaOH濃度0.001mol/L，提取溫度45℃，提取時(shí)間40 min，料液比1∶25（g/mL），在此條件下蛋白質(zhì)的提取理論值達(dá)到9.75mg/g。

響應(yīng)面法；堿溶酸沉；葡萄籽蛋白質(zhì)

葡萄是世界普遍栽培的水果之一，大部分的葡萄用于釀酒，近幾十年來我國的葡萄酒行業(yè)發(fā)展迅猛，在葡萄酒的加工過程中，有約20%～30%的葡萄皮渣、籽等下腳料，大部分酒廠會(huì)直接扔掉或廉價(jià)賣給農(nóng)民做飼料及燃料。這樣做不僅造成了環(huán)境污染，而且也是資源的浪費(fèi)。而從中提取出有效物質(zhì)并進(jìn)行加工利用，既可以降低生產(chǎn)成本，又可以提高資源的利用率［1-2］。隨著對葡萄皮籽中化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)葡萄皮籽中有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如油脂、蛋白、原花青素等。

目前，對葡萄籽的開發(fā)利用引起的國內(nèi)外廣泛的關(guān)注，主要集中在葡萄籽油、抗氧化物質(zhì)的提取與利用，而對葡萄籽蛋白的提取利用較少。葡萄籽制油后的餅粕中含有13%～16%的蛋白質(zhì)，采用脫殼制油工藝餅粕蛋白質(zhì)含量高達(dá)30.39%，且葡萄籽蛋白含有18種氨基酸，人體必需的8種氨基酸俱全，其中纈氨酸、精氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸含量都相當(dāng)于大豆蛋白中的含量，由于其含有豐富的多種氨基酸、維生素及礦物質(zhì)等，具有保健、美容之功效［2］。為合理利用這一資源，我們對新疆石河子本地的葡萄品種赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)的提取進(jìn)行了研究。

1　材料與方法

1.1主要材料和儀器

赤霞珠葡萄籽：新疆石河子市；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、石油醚、氫氧化鈉、95%乙醇、磷酸等：均為國產(chǎn)分析純。

FW80型粉碎機(jī)：溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠；BS224S型分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GRX20型干熱消毒箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SH21-1型磁力攪拌器：上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；其他為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。

1.2方法

1.2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管（編號1、2、3、4、5、6）分別加入100μg/mL牛血清蛋白（BSA）0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL。各管用蒸餾水補(bǔ)齊至1.0 mL。各加考馬斯亮藍(lán)工作液5 mL?；旌暇鶆蚝笥诜止夤舛扔?jì)595 nm處測吸光值，1 h內(nèi)測完。以BSA濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測定

將堿溶上清液的pH分別調(diào)到3.50、3.68、3.80、3.90、4.00、4.10、4.20、4.40、4.60、5.00，靜置30 min后離心，測定上清液蛋白質(zhì)含量，含量最少的即為葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。

1.2.3赤霞珠葡萄籽的預(yù)處理

將葡萄籽通過粉碎機(jī)粉碎，過40目篩。稱取40 g葡萄籽粉于250 mL燒杯中，按1∶5（g/mL）的料液比加入石油醚放在磁力攪拌器上攪拌6 h后，靜置5 min～6 min使固液分離，倒出上清液回收利用。然后向固相中按1∶10（g/mL）的料液比重新倒入石油醚，磁力攪拌6 h，倒出上清液回收利用，固相葡萄籽粉用蒸餾水清洗后曬干收集備用。

1.2.4葡萄籽蛋白質(zhì)提取工藝流程

葡萄籽→預(yù)處理→堿溶酸沉［3］→離心（4 000 r/min，15 min）取上清液→加酸調(diào)節(jié)等電點(diǎn)→離心取沉淀→冷凍干燥→葡萄籽蛋白質(zhì)

1.2.5單因素試驗(yàn)

選擇影響蛋白質(zhì)得率的因素：浸提溫度（30、35、40、45、50℃）、浸提時(shí)間（20、30、40、50、60 min）、NaOH濃度（1×10-5、5×10-5、10×10-5、50×10-5、100×10-5mol/L）、料液比［1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）］進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別考察各個(gè)單因素對葡萄籽蛋白質(zhì)提取的影響。

1.2.6響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選取對葡萄籽蛋白質(zhì)提取效果影響較大的4個(gè)因素，采用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert.8.05建立四因素三水平的Central Composite模型，通過試驗(yàn)確立最佳提取工藝參數(shù)。變量因素編碼表及水平見表1。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)一式三份進(jìn)行，數(shù)據(jù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）。數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.0以及Design-Expert. 8.05軟件。

表1　響應(yīng)面自變量因素編碼及水平Table 1　Factors and levels in response surface test

2　結(jié)果與討論

2.1蛋白質(zhì)含量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1　蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　The standard curve of protein content

如圖1所示，蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.00748x+ 0.008 05，R2=0.998 5。

2.2赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定

赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)測試見圖2。

圖2　蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測定Fig.2　The determination standard of isoelectric point on protein

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)沉淀的最多，上清液中蛋白質(zhì)殘留越少說明沉降的蛋白質(zhì)的量越多［4］，由圖2可知，赤霞珠蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH 3.8。

2.3單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1提取溫度對提取量的影響

在提取時(shí)間30 min、料液比1∶10（g/mL）、NaOH濃度0.01 mol/L、不同溫度的條件下，赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)的提取量如圖3所示。

圖3　溫度對蛋白質(zhì)提取的影響Fig.3　Influence of temperature on protein extraction

由圖3可知，最佳提取溫度為45℃，之后隨著溫度的升高葡萄籽蛋白質(zhì)提取量下降，可能是溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，溶解度降低。

2.3.2提取時(shí)間對提取量的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶10（g/mL）、NaOH濃度0.01 mol/L、不同時(shí)間的條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)的提取量如圖4所示。

圖4　提取時(shí)間對蛋白質(zhì)提取的影響Fig.4　Influence of time on protein extraction

由圖4可知，隨著浸提時(shí)間的延長蛋白質(zhì)的提取量也隨之增長，在40 min之后增加較為緩慢，考慮到能耗等問題，最佳提取時(shí)間選取40 min為宜。

2.3.3NaOH濃度對提取量的影響

在提取溫度45℃、料液比1∶10（g/mL）、提取時(shí)間40 min、不同NaOH濃度的條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)的提取量如圖5所示。

由圖5可知，隨著NaOH濃度的升高，蛋白質(zhì)的提取率也逐漸升高，但濃度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致提取量變低［5］，綜合考慮選取NaOH濃度為50× 10-5mol/L為宜。

2.3.4液料比對提取率的影響

在提取溫度45℃、NaOH 50×10-5mol/L、提取時(shí)間40 min、不同液料比的條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)的提取量如圖6所示。

圖5NaOH濃度對蛋白質(zhì)提取的影響Fig.5　Influence of the concentration of NaOH on protein extraction

圖6　液料比對蛋白質(zhì)提取的影響Fig.6　Influence of liquid to solid ratio on protein extraction

由圖6可知，隨著液料比的增加，蛋白質(zhì)溶解的量也增大，所以赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)的提取量也增加，但是在液料比在1∶20（g/mL）之后，蛋白質(zhì)的提取量增加緩慢，綜合考慮，選取料液比1∶20（g/mL）為宜。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化分析

赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)提取的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，蛋白質(zhì)提取量回歸模型方差分析見表3。

表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2　Test design and results of response surface

續(xù)表2　響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2　Test design and results of response surface

表3　蛋白質(zhì)提取量回歸模型方差分析Table 3　Analysis of variance to the extraction volume of protein

根據(jù)表2響應(yīng)面分析法試驗(yàn)結(jié)果，對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析［6］，得到葡萄籽蛋白提取量與各因素變量的二次方程模型：蛋白質(zhì)的提取量=3.89-0.14×A+0.49C+4.21×D-0.30×A×B-0.35×A×B+0.44×C× D-0.23×A2-0.22×B2+0.66×D2

由表3中的回歸模型的方差分析可知，模型的P＜0.000 1，失擬項(xiàng)的P=0.079 3＞0.05，不顯著，表明建立的該模型可以用來分析和預(yù)測葡萄籽蛋白提取的工藝參數(shù)。同時(shí)由表3中的回歸模型顯著性分析可知，A、C、D、AB、AC、CD、A2、B2、D2對葡萄籽蛋白提取率的影響顯著，B對葡萄籽蛋白得率的影響不顯著。

溫度與時(shí)間、溫度與NaOH濃度、NaOH濃度與料液比互作用的等高線和響應(yīng)面圖分別見圖7、圖8、圖9。

圖7　溫度與時(shí)間互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.7　Response surface and contour plots of temperature and time

圖8　溫度與NaOH濃度互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.8　Response surface and contour plots of temperature and NaOH concentration

圖9　NaOH濃度與料液比互作用等高線和響應(yīng)面圖Fig.9　Response surface and contour plots of NaOH concentration and liquid to solid ratio

由圖7可得，等高線圖呈橢圓形，說明溫度與時(shí)間之間的交互作用顯著，由溫度與時(shí)間的3D圖可看出，葡萄籽蛋白提取率隨溫度變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較顯著［7］，與回歸模型的方差分析結(jié)果相符。

由圖8可得，溫度和NaOH濃度的等高線圖呈橢圓形，說明兩者之間的交互作用較顯著，并且由溫度和NaOH的3D圖可知，葡萄籽蛋白提取率隨溫度變化的坡度較陡，溫度對其影響較大，兩者之間的交互作用較顯著［8］，與回歸模型的方差分析結(jié)果相符。

由圖9可得，等高線圖直線圓形，說明NaOH濃度和液料比之間的交互作用不顯著，由NaOH濃度和液料比的3D圖可看出，葡萄籽蛋白提取率隨液料比變化的坡度較陡，彼此之間的交互作用較不顯著。

2.5響應(yīng)面結(jié)果分析及驗(yàn)證試驗(yàn)

由模型方程計(jì)算可得，葡萄籽蛋白提取率的最優(yōu)試驗(yàn)方案為溫度45.17℃、時(shí)間49.57min、料液比1∶ 25（g/mL），在此條件下的蛋白提取率的理論值達(dá)到9.78 mg/g。根據(jù)試驗(yàn)的實(shí)際情況將試驗(yàn)條件調(diào)整為溫度45℃、時(shí)間40 min、料液比1∶25（g/mL），重復(fù)試驗(yàn)3次，最終得到的葡萄籽蛋白提取率的平均值為9.75 mg/g，與理論值基本一致。結(jié)果表明，該模型可以較好地反映出葡萄籽蛋白提取的條件，從而也證明了響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取葡萄籽蛋白條件參數(shù)的可行性。

3　結(jié)論

在本文中，通過響應(yīng)面法全面且直觀地分析了各因素對葡萄籽蛋白提取率的影響，以及各因素之間對提取過程的交互影響，建立了二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，經(jīng)驗(yàn)證該模型合理可靠，表明影響浸提效果的主要因素是溫度與料液比。赤霞珠葡萄籽蛋白質(zhì)最佳提取條件為：浸提溫度45℃，料液比1∶25（g/mL），浸提時(shí)間40 min，NaOH濃度0.001 mol/L，經(jīng)過驗(yàn)證試驗(yàn)，葡萄籽蛋白的提取量為9.75 mg/g，工藝參數(shù)可供生產(chǎn)應(yīng)用參考。

［1］張愛軍，沈繼紅，馬小兵，等.葡萄籽的開發(fā)與利用［J］.中國油脂，2004，29（3）：55-57

［2］魏福祥，韓菊.葡萄廢渣的綜合利用研究［J］.河北工業(yè)科技，2001，18（2）：27-30

［3］李鳳英，權(quán)英.堿溶法提取葡萄籽中蛋白質(zhì)的工藝［J］.河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，17（3）：26-28，32

［4］周建華.葡萄籽中提取油和蛋白質(zhì)的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2000（10）：48-49

［5］李甜甜，李保國，郭雯麗，等.響應(yīng)面優(yōu)化微博輔助提取豆渣水溶性膳食纖維［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（8）：23-28

［6］Davidson J，Ekramoddoullah A K M.Analysis of barkproteins in blister rust-resestant and susceptible western white pine（Pinus monticola）［J］.Tree Physiology，1997，17（10）：663-669

［7］牛博楠，許程劍，劉冰，等.超聲波輔助提取新疆阿魏菇蛋白質(zhì)工藝優(yōu)化［J］.食品研究與開發(fā)，2014，35（8）：29-33

［8］周麗卿，杜雙奎，趙佳，等.響應(yīng)面法優(yōu)化鷹嘴豆蛋白質(zhì)提取工藝［J］.食品科學(xué)，2012，33（8）：66-70

Optimizing Extraction Technology of Protein from Grape Seed with Respones Surface Methodology

WU Fang，LI Kai-xiong，LI Ying-biao，CHEN Shuai，XU Cheng-jian*
（College of Food Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，Xinjiang，China）

Alkali-solution and acid-isolation method was used to extract protein from Cabernet Sauvignon grape seed to improve the utilization rate of grape seed，in which respones surface analysis was used to optimize extraction conditions.Based on the single factor experiments，the Central Composite design principles and Design-Expert.8.05 data ananlysis software were used to select four parameters of response surface design to optimize extraction process.The result showed the optimize extraction conditions：the concentration of NaOH 0.001 mol/L，extraction temperature 45℃，extraction time 40 min，liquid to solid ratio 1∶25（g/mL），the extraction value was 9.75 mg/g.

respones surface methodology；alkali-solution and acid-isolation；grape seed protein

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.025

吳芳（1982—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品加工與安全。
*

許程劍（1978—），男，副教授，工學(xué)博士，天然產(chǎn)物制備與功能活性研究。

2015-04-20