郭艷萍，趙金安（太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008）

葡萄酵素天然發(fā)酵過程中抗氧化性能研究

郭艷萍，趙金安
（太原工業(yè)學(xué)院環(huán)境與安全工程系，山西太原030008）

采用分光光度法通過測(cè)定黑雞心葡萄酵素天然發(fā)酵過程中不同階段的總酚含量、還原能力及其對(duì)DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基的清除率來評(píng)價(jià)天然酵素的抗氧化性能。結(jié)果顯示：黑雞心葡萄天然酵素在發(fā)酵過程中總酚含量上升，對(duì)DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢(shì)，發(fā)酵前后分別提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%增幅較大，同時(shí)顯示出與酵素總酚含量的變化有明顯的正相關(guān)性。

黑雞心葡萄酵素；天然發(fā)酵；抗氧化性

葡萄酵素是以葡萄為原料，經(jīng)過多種有益菌發(fā)酵制得的含有多種微生物次生代謝產(chǎn)物、維生素和礦物質(zhì)的液態(tài)微生物發(fā)酵產(chǎn)品［1］。酵素參與人類生命活動(dòng)的各種生理生化反應(yīng)，是人體不可或缺的物質(zhì)。研究表明，天然酵素具有抗氧化性能，可清除人體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷［2］。目前，國(guó)外研究人員已用生物技術(shù)提取天然酵素，將其加入到美容產(chǎn)品和保健食品中，就國(guó)內(nèi)而言，天然酵素產(chǎn)品的應(yīng)用范圍還不是很廣泛，隨著人們保健意識(shí)的增強(qiáng)，消費(fèi)觀念的轉(zhuǎn)變，酵素作為一種純天然的、多功能的、安全性較高的食品、保健品和化妝品原料，具有很廣闊的應(yīng)用前景［3］。

黑雞心葡萄是山西特有的葡萄品種之一［4］，色澤黑紫，形似雞心，果粒密實(shí)，柔軟多汁，但其含酸量較高果實(shí)生食口感較差，種植率下降，品種急需保護(hù)。本研究采用分光光度法對(duì)黑雞心葡萄酵素天然發(fā)酵過程中的總酚含量、DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基清除率和還原力進(jìn)行了測(cè)定，為天然黑雞心葡萄酵素的生產(chǎn)研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支持，旨在為黑雞心葡萄的多功能開發(fā)利用以及品種保護(hù)提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

山西清徐黑雞心葡萄：取自山西清徐縣徐溝鎮(zhèn)果園；三氯乙酸、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、硝基四氮唑藍(lán)（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、沒食子酸、酚試劑、α，α-二苯基-β-苦苯肼（DPPH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀：均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

SW-C1-IPD-Z型潔凈工作臺(tái)：上海安因科技有限公司；數(shù)顯pH儀：美國(guó)Thermo賽默飛世爾科技；TGL-16G-C高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；752N型紫外可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1葡萄酵素的制備［5］

黑雞心葡萄洗凈、晾干，再與冰糖（紫外滅菌）按質(zhì)量比1∶1加入到無菌玻璃瓶中，密封常溫下發(fā)酵，以上步驟均在無菌操作臺(tái)中進(jìn)行。發(fā)酵開始后，每6天為一階段取樣，樣品10 000 r/min冷凍高速離心15 min后進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定。

1.3.2葡萄酵素pH的測(cè)定

發(fā)酵過程中每隔6天用pH計(jì)測(cè)定葡萄酵素的pH。

1.3.3總酚含量測(cè)定［6］

配置一系列濃度的沒食子酸，加入顯色劑后在765 nm下測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，y=0.092 0x+ 0.020 8，R2=0.999 9。取各階段葡萄酵素樣品100 μL加入45.9 mL去離子水，1 mL酚試劑，3 mL Na2CO3溶液（20 g/100 mL），25℃恒溫水浴2 h后765 nm下測(cè)吸光度。

1.3.4DPPH·清除能力［6］

取不同階段葡萄酵素樣品40 μL加入到4 mL DPPH乙醇溶液中，再加入450 μL Tris-鹽酸緩沖液（50 mmol/L，pH7.4），混勻避光，25℃恒溫水浴1 h后517 nm下測(cè)吸光度A517。

式中：Ac為DPPH溶液與等體積無水乙醇混合時(shí)的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.5超氧自由基（O2-·）清除能力

采用鄰苯三酚法［7］：取不同階段葡萄酵素樣品50 μL加入到950 μL磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH7.4），再加入1 mL 936 μmol/L NADH，1 mL 300 μmol/L NBT 和1 mL 120 μmol/L PMS。25℃反應(yīng)5 min后560 nm下測(cè)吸光度A560。

式中：Ac為空白對(duì)照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.6羥基自由基（·OH）清除能力

采用水楊酸法［7］：取不同階段葡萄酵素樣品135 μL加入到1.4 mL 6 mmol/L H2O2，充分混勻后加入0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL1.5 mmol/L FeSO4，25℃下恒溫水浴1 h后562 nm下測(cè)定吸光度A562。

式中：Ac為空白對(duì)照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.7ABTS自由基清除能力［8］

ABTS母液：用pH7.4的5mmol/LPBS配制7mmol/L ABTS，加入過硫酸鉀至濃度為2.45mmol/L，25℃下避光放置12 h。用PBS稀釋母液在734 nm下吸光度為0.7。

取不同階段葡萄酵素樣品10 μL加入到5 mL ABTS母液中，30℃恒溫水浴反應(yīng)5 min后734 nm下測(cè)定吸光度A734。

式中：Ac為空白對(duì)照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.8還原力測(cè)定

采用普魯士藍(lán)法［7］。取不同階段葡萄酵素樣品30μL加入到2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）中，再加入1%K3［Fe（CN）6］2.5 mL，50℃恒溫水浴半小時(shí)，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，6 000 r/min離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入等體積去離子水和0.1%三氯化鐵0.5 mL。700 nm下測(cè)定吸光度A700，吸光度值越高，還原力越強(qiáng)。

2　結(jié)果與分析

2.1葡萄酵素pH的變化

天然發(fā)酵過程中不同階段黑雞心葡萄酵素pH隨時(shí)間的變化（圖1）。

圖1發(fā)酵過程中pH變化Fig.1　pH changes during fermentation

葡萄酵素在發(fā)酵初期pH從5.99降到4.55，之后在12 d稍有回升，到18 d再次降到3.08，之后趨于平穩(wěn)。pH變化過程顯示出葡萄酵素由于葡萄本身所含有的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等酸性物質(zhì)使初始pH為酸性。酵素在12 d至18 d內(nèi)快速發(fā)酵，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的二氧化碳溶解在酵液中，也使得pH降低。隨著發(fā)酵進(jìn)行進(jìn)入緩慢發(fā)酵階段，酵液中微生物對(duì)葡萄蛋白的降解利用，使得pH稍有回升呈波形起伏。

2.2葡萄酵素總酚含量的測(cè)定

按照1.3.3總酚含量的測(cè)定方法，測(cè)得黑雞心葡萄酵素總酚含量在發(fā)酵過程中各階段的變化見圖2。

圖2 發(fā)酵過程中總酚含量變化Fig.2　Total phenolic changes during fermentation

圖2顯示，葡萄酵素總酚含量在發(fā)酵過程中逐步上升，至30 d達(dá)到最大值2.852 mg/mL后下降并趨于穩(wěn)定，但總酚含量仍高于發(fā)酵初始時(shí)含量。發(fā)酵在最初的30 d內(nèi)逐步增加，之后趨于穩(wěn)定。酵素發(fā)酵初期酵母等微生物快速繁殖，此時(shí)酚類物質(zhì)伴隨著碳源氮源的消耗而釋放出來，使得總酚含量增加。隨著發(fā)酵進(jìn)行，酚類物質(zhì)已基本溶出，溶出速率趨于平穩(wěn)。

2.3葡萄酵素對(duì)DPPH·清除能力

有研究表明多酚類物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)中的核心功能組有關(guān)，并且這類特殊的核心功能組結(jié)構(gòu)可清除自由基、螯合金屬離子及氧化活性物質(zhì)。DPPH·是人工合成的脂溶性自由基，廣泛用于測(cè)定物質(zhì)的抗氧化性，更廣泛的應(yīng)用于測(cè)定葡萄及葡萄酒的抗氧化性［9］。葡萄酵素發(fā)酵各階段DPPH·的清除作用如圖3所示。

圖3 發(fā)酵過程中DPPH·清除能力變化Fig.3　DPPH·scavenging ability changes during fermentation

由圖3可看出，葡萄酵素對(duì)DPPH·有較高的清除能力，發(fā)酵前后清除率增加6.84%，第30天出現(xiàn)最大值94.87%，發(fā)酵后期略有下降。結(jié)合圖2來看，葡萄酵素對(duì)自由基的清除能力變化與總酚含量變化曲線相似，均在發(fā)酵初期第6天有小幅升高，在18天小幅回落，在30天出現(xiàn)峰值后下降。有研究表明，酚類物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性。葡萄酵素發(fā)酵過程中逐步釋放出酚類物質(zhì)，酚類物質(zhì)的積累使得酵素的抗氧化活性增強(qiáng)。

2.4葡萄酵素對(duì)超氧自由基（O2-·）清除能力

O2-·是人體內(nèi)活性氧的一種，可作為自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生活性更強(qiáng)的自由基引起蛋白質(zhì)、核酸和脂類的氧化損傷。葡萄酵素發(fā)酵各階段對(duì)O2-·的清除作用見圖4。

圖4　發(fā)酵過程中O2-·清除能力變化Fig.4　O2-·scavenging ability changes during fermentation

圖4顯示，葡萄酵素發(fā)酵過程中對(duì)O2-·清除能力的增幅最大，發(fā)酵前6 d清除率急劇增大，6 d～12 d略有降低，12 d～24 d持續(xù)增高，到30天達(dá)到最大值，發(fā)酵前后清除率增加了19.82%。

2.5葡萄酵素對(duì)羥基自由基（·OH）清除能力

·OH是生物體產(chǎn)生的一種反應(yīng)活性極高的自由基，具有極強(qiáng)的得電子能力也就是氧化能力，可損傷細(xì)胞膜，導(dǎo)致疾病發(fā)生。葡萄酵素發(fā)酵各階段對(duì)·OH的清除作用見圖5。

圖5發(fā)酵過程中·OH清除能力變化Fig.5·OH scavenging ability changes during fermentation

圖5顯示，葡萄酵素對(duì)·OH的清除能力相對(duì)于其它自由基的清除能力較低，但高于其它天然酵素［2］對(duì)·OH的清除能力。葡萄酵素對(duì)·OH的清除能力在第6天出現(xiàn)小幅增強(qiáng)后迅速降低，18 d降至最低值后急速上升，在30 d時(shí)達(dá)到54.84%，比未發(fā)酵時(shí)增加了7.32%。

2.6葡萄酵素對(duì)ABTS自由基清除能力

葡萄酵素發(fā)酵各階段對(duì)ABTS自由基的清除作用如圖6所示。

圖6　發(fā)酵過程中ABTS自由基清除能力變化Fig.6　ABTS radical scavenging ability changes during fermentation

由圖6可知，發(fā)酵過程中葡萄酵素對(duì)ABTS自由基的清除作用較強(qiáng)，除12天有小幅降低外清除能力持續(xù)增高，30天時(shí)出現(xiàn)最大值88.89%，發(fā)酵前后清除率增加14%左右。ABTS自由基的清除能力常被用來衡量葡萄及葡萄制品的抗氧化性，黑雞心葡萄酵素對(duì)其清除能力較高說明抗氧化性較好，有一定的開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值。

2.7葡萄酵素發(fā)酵過程中還原力的變化

葡萄酵素發(fā)酵各階段還原力的變化如圖7所示。

圖7　發(fā)酵過程中還原力變化Fig.7　Reducing power changes during fermentation

由圖7可知，葡萄酵素發(fā)酵過程各階段還原力呈波浪形不規(guī)則變化，大幅上升后大幅回落，發(fā)酵后期又大幅上升無規(guī)律可尋。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明在天然條件下，以山西特有葡萄品種黑雞心為原料，經(jīng)過多種有益菌發(fā)酵制得的黑雞心葡萄酵素有較好的抗氧化的能力，并且經(jīng)發(fā)酵30 d產(chǎn)生的酵素抗氧化能力最強(qiáng)?？寡趸阅軓淖杂苫宄屎瓦€原力兩方面考查，得出以下結(jié)論：發(fā)酵過程中葡萄酵素對(duì)DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢(shì)，發(fā)酵前后分別提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%，增幅較大。還原力呈波浪形不規(guī)則變化，呈上升趨勢(shì)，抗氧化能力間歇性增強(qiáng)。對(duì)葡萄酵素發(fā)酵各階段總酚含量的測(cè)定結(jié)果表明，葡萄酵素在發(fā)酵過程中總酚含量上升，酵素對(duì)自由基的清除能力與總酚含量的變化呈相同趨勢(shì)，具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果可為天然黑雞心葡萄酵素的生產(chǎn)研發(fā)提供一定的數(shù)據(jù)支持，為黑雞心葡萄的多功能開發(fā)利用以及品種保護(hù)提供理論依據(jù)。

［1］毛建衛(wèi)，吳元峰，方晟.微生物酵素研究進(jìn)展［J］.發(fā)酵科技通訊，2010，39（3）：42-43

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［4］郭艷萍，劉美林，賀東亮，等.抑制劑對(duì)黑雞心葡萄多酚氧化酶活性的影響［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014（5）：477-480

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［8］李華，李勇，吳瑩.ABTS法測(cè)定葡萄酒抗氧化活性的研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，37（11）：90-96

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Changes in Antioxidant Activity of Black Heart Grapes-ferment during Natural Fermentation Process

GUO Yan-ping，ZHAO Jin-an
（Department of Environmental and Safety Engineering，Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，Shanxi，China）

To investigate the antioxidant ability of black heart grapes-ferment，the content of total phenol，DPPH·，·OH，O2-·，ABTS radical scavenging ability during fermentation process were determined by spectrophotometer.The results indicated that the amount of total phenolics were increased during fermentation process.Before and after fermentation the DPPH·、·OH、O2-·、ABTS radical scavenging ability were increased by 6.84%，19.82%，7.32%and 14.81%，showed a high antioxidant capacity.The change of antioxidant activity was relevant to the change of total phenolics.

black heart grapes-ferment；natural fermentation；antioxidant ability

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.009

太原工業(yè)學(xué)院青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2013LQ01）；山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（2013375）

郭艷萍（1984—），女（漢），講師，碩士，研究方向：植物蛋白質(zhì)工程。

2015-04-28