魏京華，陳歷俊，趙軍英，張 毅，景萌娜，王 品，姜鐵民，*，喬為倉（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116000；.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163）

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液相色譜-質(zhì)譜法快速檢測4 種乳源低聚糖

魏京華1，2，陳歷俊1，2，趙軍英2，張 毅2，景萌娜1，2，王 品1，2，姜鐵民2，*，喬為倉2
（1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116000；2.北京三元食品股份有限公司國家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京 100163）

建立一種乳樣經(jīng)簡單預(yù)處理后采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測4 種重要的乳源低聚糖方法。牛乳及人乳經(jīng)過脫脂、脫蛋白后經(jīng)amide液相色譜柱用0.1%氨水-乙腈溶液梯度分離，采用質(zhì)譜檢測。2 種唾液酸乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.78～50.00 mg/L范圍內(nèi)線性良好（R2＞0.990），2 種巖藻糖乳糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線在1.56～100.00 mg/L范圍內(nèi)線性良好（R2＞0.990）。加標(biāo)回收率在80.00%～100.00%之間，重復(fù)性、精密度實驗所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.00%。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；低聚糖；牛乳；人乳

牛乳是一個復(fù)雜的混合物，它是由脂質(zhì)、低聚糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和其他生物活性物質(zhì)組成［1］。而低聚糖作為人乳中除蛋白、脂類之外的第三大豐富的物質(zhì)，含量在7～12 g/L。不同低聚糖在含量、結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量方面存在很大差異［2］，它們是由2～10 個單糖殘基通過糖苷鍵共價連接形成［3］，不僅包括多種高度支化的種類，還有同一分子質(zhì)量不同結(jié)構(gòu)排列，有100 種以上結(jié)構(gòu)［4-5］，是一種極其復(fù)雜的混合物。乳源低聚糖是兒童生長發(fā)育的主要營養(yǎng)物質(zhì)之一，對青少年智力發(fā)育也十分重要［6］。此外，有報道［7］表明雙歧桿菌可以在以純化的人乳低聚糖作為唯一碳源的環(huán)境中生長，這也證實了人乳低聚糖可以刺激有益雙歧桿菌在嬰兒腸道內(nèi)增長這一假說。低聚糖也可以通過抑制病原體在小腸黏膜表面的附著力來防止感染［8］。特別的是，人乳因其中巖藻糖乳糖和唾液酸乳糖含量高，被認為是獨一無二的［9］。作為牛乳、人乳中含量都相對高的唾液酸乳糖，對嬰幼兒大腦發(fā)育至關(guān)重要［10］。

低聚糖有著如此重要的作用，研究其生物學(xué)功能的必要前提是對大批量的乳樣中低聚糖進行定量分析［11］。然而，乳源低聚糖結(jié)構(gòu)復(fù)雜同分異構(gòu)種類多，同時檢測出所有低聚糖有一定難度。因此，本實驗選擇對嬰幼兒生長發(fā)育具有重要生物學(xué)功能的乳源低聚糖為代表，檢測其含量。

目前常用的低聚糖分離和結(jié)構(gòu)鑒定方法有：離子色譜、高效液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、毛細管色譜。方法比較見表1。

表1 幾種低聚糖檢測方法比較Table1 Comparis on s of several methods used for oligosaccharide detecti on

比較近年來低聚糖檢測的各種方法，不難看出低聚糖的檢測一般分為2 個過程，一是液相分離；二是分離后經(jīng)檢測器檢測。而目前應(yīng)用廣泛的是液相色譜的一些比較常用的檢測器以及質(zhì)譜。但是與常用檢測器相比較，質(zhì)譜作為檢測器時可以根據(jù)其提供的相對分子質(zhì)量和子離子信息以及子離子所對應(yīng)的質(zhì)譜圖，更快更準(zhǔn)確地定性與定量，很好地解決了同分異構(gòu)體由于分子質(zhì)量相同結(jié)構(gòu)相似而在液相中不能完全分離無法定性定量這一難題。

據(jù)目前報道［26］來看，乳樣前處理一般采用還原法，即乳樣離心脫除脂和蛋白后用NaBH4還原，經(jīng)石墨碳柱洗脫后真空干燥，最后用去離子水溶解經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測。這種處理方法復(fù)雜，洗脫過程費時，對樣品損耗多，且目前報道鮮見同時檢測人乳和牛乳的方法。本實驗旨在開發(fā)一種經(jīng)簡單處理后可快速準(zhǔn)確并可同時檢測乳源低聚糖的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳、人乳 北京三元食品股份有限公司；3-巖藻糖乳糖（3-fucosyllactose，3-FL） 法國Elicityl-OligoTech公司；2′-巖藻糖乳糖（2′-fucosyllactose，2′-FL）、6′-唾液酸乳糖（6′-sialyllactose，6′-SL）英國Dextra Laboratories公司；3′-唾液酸乳糖（3′-sialyllactose，3′-SL） 美國Sigma公司；無水乙醇（分析純） 北京化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

超低溫冰箱 美國Thermo公司；D-37520微量高速離心機 美國Thermo Scientific Sorvall公司；Milli-Q A10超純水凈化器 美國Millipore公司；3K-15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；AL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；0.22 μm濾膜 美國Agela公司；ACQUITY超高效液相色譜儀、TQD電噴霧串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液：所購4 種標(biāo)準(zhǔn)品均為1 mg，將其溶解在1 mL水中，搖勻備用，即得含量為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

取3′-SL、6′-SL各50 μL，2′-FL、3-FL各100 μL，混合后加水至1 mL，混勻，此時3′-SL、6′-SL質(zhì)量濃度為50 mg/L，2′-FL、3-FL質(zhì)量濃度為100 mg/L。取此混合液逐級稀釋配制不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液質(zhì)量濃度Table 2 C on centrati on s of st and ardsoluti on s

1.3.2 樣品前處理

目前牛乳和人乳中脫除蛋白質(zhì)的方法主要有2 種，乙醇沉淀法［27］和乙腈沉淀法［11］，為建立一種提取乳源低聚糖的快速方法，本實驗對2 種方法進行對比，具體如下。

乳樣在4 000×g、4 ℃條件下離心15 min脫除上層脂，下層清液添加2 倍體積分數(shù)66.7%乙醇溶液，混勻后在-80 ℃放置30 min，取出經(jīng)13 000 r/min離心30 min脫除下層蛋白質(zhì)取上層清液加水稀釋，待檢測。

乳樣添加3 倍體積乙腈（1∶1，V/V）溶液，手搖振蕩后采用超聲均質(zhì)2 min，然后在室溫條件下8 000 r/min離心15 min，取清液加水稀釋，待檢測。

1.3.3 超高效液相色譜條件

A C Q U I T Y U P L C B E H a m i d e液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫30 ℃；流動相A為乙腈，B為0.1%氨水；流速150 μL/min；在實驗室所建立的分離方法基礎(chǔ)上，優(yōu)化得到流動相梯度洗脫條件，流動相梯度洗脫程序，見表3。

表3 流動相梯度洗脫程 序Table 3 Gradients of mobilephasesA and B

1.3.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（負離子模式）；負離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測；毛細管電壓3.8 kV；錐孔電壓21 V；離子源溫度120 ℃；脫溶劑溫度350 ℃；脫溶劑氣（N2）流量700 L/h；錐孔反吹氣流量30 L/h；碰撞氣（Ar）流量0.14 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

2 種前處理方法處理同一種乳樣，采用相同的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件檢測，檢測結(jié)果見表4。

表4 2 種前處理方法條件下檢測含量比較Table 4 Comparis on of twosamplepretreatment methods used for oligo sac ch aride deter m in a ti on

由于2′-FL和3-FL在牛乳中含量極少，且響應(yīng)值很低，故檢測不到。由表4可看出，無論是牛乳還是人乳，經(jīng)第2種方法處理后含量減少，人乳中3′-SL、 6′-SL、2′-FL、3-FL含量分別減少8.13%、9.52%、12.58%、1.09%，而牛乳中3′-SL、6′-SL含量分別減少19.95%、2.25%。推測原因，可能是乙腈對蛋白的沉淀率比較高，沉淀蛋白多，使低聚糖夾雜在蛋白里一起沉淀，但鮮見文獻報道證明，具體原因還需要進一步確定。因此由表中比較得出，本實驗采取乙醇沉淀蛋白的方法，即選用第1種前處理方法。

2.2 質(zhì)譜條件的確定

在負離子模式下，對低聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品進行離子全掃描，以確定4 種糖的準(zhǔn)分子離子并優(yōu)化質(zhì)譜條件。以其準(zhǔn)分子離子為其母離子，對其子離子進行全掃描，選擇豐度較高的2 個離子分別作為定性和定量離子（響應(yīng)值高的子離子為定量離子，另外一個為定性離子）；其分子結(jié)構(gòu)見表5。在負離子和多反應(yīng)監(jiān)測模式下優(yōu)化各種質(zhì)譜調(diào)諧參數(shù)，以提高檢測靈敏度，如圖1所示。

表5 4 種低聚糖結(jié)構(gòu)Table 5 Structures of 4o ligosaccharides

圖1 4 種糖的總離子掃描圖Fig.1 Full scan mass spectra of4 oligosaccharides

圖1中從各種低聚糖圖譜中選取的子離子信息如表6所示。目前文獻中報道的是還原后的母離子及相應(yīng)子離子［20］，因還原后分子質(zhì)量增加，因此在相同的質(zhì)譜條件下，所產(chǎn)生的子離子信息不同。本實驗給出未還原低聚糖的母離子及子離子信息，為低聚糖檢測方法的建立提供重要的參數(shù)依據(jù)。

表6 質(zhì)譜檢測參數(shù)Table 6 Mass spectral parameters

2.3 色譜條件的選擇

因本實驗所選擇為2 組同分異構(gòu)體，尤其是SL的2 個同分異構(gòu)體，由表6可知，兩者選取的子離子信息相同，因此必須優(yōu)化超高效液相色譜梯度洗脫條件將兩者分離，才能達到同時檢測的目的。在已得到的最優(yōu)色譜條件下，4 種低聚糖標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)超高效液相色譜分離，如圖2所示。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的液相色譜圖Fig.2 Chromatograms of mixed standard solutions and2 samples

如圖2所示，在本實驗優(yōu)化的超高效液相梯度洗脫條件下，4 種代表性低聚糖得到較好的分離，可進一步采用質(zhì)譜檢測?，F(xiàn)有文獻報道中，梯度洗脫時間多為40 min以上［20，27］，而本實驗所建立梯度洗脫時間僅有20 min，有效提高了檢測速度，更適用于大批量樣品的檢測。

對不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行色譜分析，以質(zhì)量濃度為X軸、峰面積為Y軸做圖，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，如表7所示。

表7 回歸方程及定量檢出限Table 7 Regressi on equati on s and limits of detecti on

由于糖的檢測響應(yīng)值比較低，質(zhì)量濃度過低檢測不準(zhǔn)確，根據(jù)Totten等［27］所做其他低聚糖和Hong等［20］所做的2′-FL、3′-SL、6′-SL的檢測范圍，將本實驗中4 種糖的檢測范圍定在0.78～100.00 μg/mL之間，而同等質(zhì)量濃度的SL明顯比FL響應(yīng)值高，為了更直觀地觀察4 種糖的色譜分離情況，故將FL的質(zhì)量濃度定為SL的2 倍。在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)回歸方程R2都在0.990以上，由此確定本實驗中4 種低聚糖在設(shè)定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4 回收率及精密度結(jié)果

由于牛乳、人乳選取相同的前處理方法，且2 種乳中低聚糖種類相似，只是在種類數(shù)量及每種含量上有所差別，所以對前處理方法回收率和精密度的方法檢測選取了2 種乳中共同有的且含量相對少的一種低聚糖3′-SL做檢測。取人乳、牛乳500 μL，分別添加3′-SL標(biāo)準(zhǔn)品50.00、25.00 μg，經(jīng)前處理后進樣檢測，如表5所示。

對于儀器的精密度采用同一樣品重復(fù)進針5 次，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）小于5.00%之間，處理方法的準(zhǔn)確性采用平行處理5 個樣檢測，得到的RSD也小于5.00%，精密度較高，說明本實驗所應(yīng)用的實驗方法和檢測儀器足夠適用于這4 種低聚糖的檢測分析。

表8 回收率檢測Table 8 Recoveries of spiked milks amples

2.5 方法比較

將本實驗所用方法與其他文獻對比，見表9。

表9 不同方法檢測結(jié)果比較Table9 Comparis on of analyticalr esults for the determ in ati on of milk oligo sac ch aride sby differe nt me tho ds

3 結(jié) 論

本實驗所建立的檢測方法與之前所報道的方法比較樣品前處理簡單、用量少且不需要繁瑣的還原、固相萃取等過程，排除了其他試劑可能造成的干擾，回收率和重復(fù)性好，且可同時檢測牛乳和人乳，完全適合4 種乳源低聚糖的檢測。本實驗對于牛乳和人乳中低聚糖的測定以及以后深入探討更多低聚糖的測定方法提供參考。

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Rapid and Simultaneous Detection of 4 Milk Oligosaccharides Using LC-MS

WEI Jinghua1，2， CHEN Lijun1，2， ZHAO Junying2， ZHANG Yi2， JING Mengna1，2， WANG Pin1，2， JIANG Tiemin2，*， QIAO Weicang2
（1.School of Biological Engineering， Dalian Polytechnic University， Liaoning 116000， China；2.National Maternal and Infant Health Dairy Researching Center of Beijing Sanyuan Foods Co.Ltd.， Beijing 100163， China）

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） method was used to rapidly and simultaneously detect 4 oligosaccharides in bovine milk and human milk.Samples were defatted， deproteined，resolved on an ACQUITY BEH amide column using gradient elution with 0.1% ammonia water/acetonitrile as mobile phase， detected by mass spectrometric specific ion monitoring and quantified.The standard curves of 2 fucosyllactose oligosaccharides were linear within the range from 0.78 to 50.00 mg/L with R2＞ 0.990.The standard curves of 2 sialyllactose were linear within the range from 1.56 to 100.00 mg/L with R2＞ 0.990.The recoveries of spiked samples ranged from 80.00% to 100.00%.The relative standard deviation （RSD） of repeatability and precision was less than 5.00%.

ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）； oligosaccharides； bovine milk； human milk

10.7506/spkx1002-6630-201614015

TS207.3

A

1002-6630（2016）14-0086-06

魏京華， 陳歷俊， 趙軍英， 等.液相色譜-質(zhì)譜法快速檢測4 種乳源低聚糖［J］.食品科學(xué)， 2016， 37（14）: 86-91.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614015. http://www.spkx.net.cn

WEI Jinghua， CHEN Lijun， ZHAO Junying， et al.Rapid and simultaneous detection of 4 milk oligosaccharides using LC-MS［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 86-91.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614015. http:// www.spkx.net.cn

2015-12-09

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B04）；北京市科技計劃項目（D141100004814002）

魏京華（1989—），女，碩士，研究方向為發(fā)酵乳制品。E-mail：weijinghua1989@163.com

*通信作者：姜鐵民（1971—），女，教授級高級工程師，碩士，研究方向為乳品加工。E-mail：jiang515910@126.com