鄭潔 王瑞輝 楊威 寇久社

1. 陜西中醫(yī)藥大學針灸推拿學院，陜西 咸陽 712046 2. 陜西中醫(yī)藥大學中醫(yī)系，陜西 咸陽 712046 3. 陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712046

骨關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種累及關節(jié)軟骨、軟骨下骨、滑膜和韌帶等關節(jié)周圍多種組織的退行性關節(jié)疾病，其具體發(fā)病機制至今仍不明確。脂肪因子是一類由白色脂肪組織分泌的內源性活性多肽，被認為與肥胖、胰島素抵抗、糖尿病等多種代謝性疾病密切相關。近來發(fā)現，瘦素(leptin)、脂聯(lián)素(adiponectin)、內脂素(visfatin)和抵抗素(resistin)等多種脂肪因子在炎性反應、軟骨退變以及軟骨下骨重塑等多個OA病理過程中發(fā)揮了重要作用[1-2]。青藤堿是從傳統(tǒng)治療風濕性疾病中藥清風藤中提取的一種生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、調節(jié)免疫、降血壓、抗心律失常等藥理作用[3]。筆者前期實驗研究發(fā)現，青藤堿關節(jié)腔注射可緩解兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)滑膜炎性反應、降低關節(jié)液脂聯(lián)素、內脂素和抵抗素水平，對軟骨具有保護作用。本實驗通過觀察青藤堿關節(jié)腔注射對木瓜蛋白酶誘導的兔KOA模型血清及關節(jié)液瘦素水平以及軟骨瘦素受體(Ob-Rb)mRNA和蛋白表達的影響，探討青藤堿治療KOA的部分作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物：新西蘭大白兔40只，雌雄各半，體質量1.8～2.2 kg，由西安交大醫(yī)學院實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(陜)2008-008。單籠、標準飼料喂養(yǎng)，室溫20℃～25℃，相對濕度45%～60%，每天正常光照，空氣流通，自由攝食、飲水。

1.1.2藥物及試劑：正清風痛寧注射液(湖南正清制藥集團股份有限公司，批號1304402-003，規(guī)格2 ml：50 mg)，玻璃酸鈉注射液(山東博士倫福瑞達制藥有限公司，批號130308011，規(guī)格2 ml：20 mg)，木瓜蛋白酶(Merck公司，貨號107147，活力6000 USP-U/mg)。瘦素ELISA試劑盒(北京諾博萊科技有限公司)，Ob-Rb多克隆抗體(英國Abcam公司)，RNA提取試劑盒(北京全式金公司)，qPCR反應試劑盒(北京全式金公司)，Ob-Rb引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)。

1.1.3儀器：Bio-Tec ELX808型酶標儀(美國Bio-Tec公司)，超薄切片機(德國LEICA公司)，5430R冷凍高速離心機(德國Eppendorf公司)，AB7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)，Thermo NanoDrop 2000C紫外分光光度計(美國Thermo公司)，濕式轉移電泳槽(美國BioRad公司)，凝膠成像儀(美國BioRad公司)，硝酸纖維素膜(Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1模型制備：采用木瓜蛋白酶關節(jié)腔注射法，分別于實驗的第1、4、7天對造模組兔進行關節(jié)腔注射。(1)木瓜蛋白酶溶液配制：將木瓜蛋白酶按4%(20 mg/0.5 mL)的濃度溶解于生理鹽水中，裝入50 mL無菌瓶中并置于 0～4℃冰箱內保存?zhèn)溆谩?2)兔關節(jié)腔注射方法：兔右膝關節(jié)備皮、75%乙醇消毒后，用左手從下方和兩旁將右側膝關節(jié)輕度屈曲位固定，右手持1 mL注射器在髕韌帶附著點外上方約 0.5 cm 處向髁間窩方向進針，當出現落空感時表明已進入關節(jié)腔內，注入4%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL。

1.2.2分組及干預措施：40只兔先分為空白組(8只)和造模組(32只)，采用木瓜蛋白酶注射法于實驗的第1、4、7天對造模組兔右膝關節(jié)腔注射0.5 mL的4%(20 mg)木瓜蛋白酶溶液。首次注射4周后隨機處死2只造模兔，病理學觀察出現典型軟骨退變表現，同時兔右膝關節(jié)出現腫脹、跛行，表明造模成功。造模成功后，將造模組隨機分為模型組(Model)、透明質酸鈉組(HA)和青藤堿組(SIN)，每組10只。根據成人用藥劑量(透明質酸鈉和青藤堿均為2 ml/次)按Meeh-Rubner公式計算人兔等效劑量，具體注射劑量為0.2 mL/次。除空白組外，對各組動物造模側膝關節(jié)行關節(jié)腔注射，青藤堿組膝關節(jié)腔注射鹽酸青藤堿注射液0.2 mL(5 mg)，每3 天一次，10次一療程，共給藥10次；透明質酸鈉組膝關節(jié)腔注射透明質酸鈉注射液0.2 mL，每6天一次，5次一療程，共5次；模型組膝關節(jié)腔注射生理鹽水0.2 mL，注射次數同青藤堿組。干預時間共計30天。實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術部頒發(fā)的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1.2.3標本采集：(1)血清采集：干預結束后第2天，耳中動脈取血5 mL，4000 r/min離心10 min，分離血清后-80℃冰箱保存?zhèn)錂z。(2)關節(jié)液采集：干預結束后第2天，生理鹽水沖洗法收集關節(jié)液。于兔的右膝關節(jié)腔內注入生理鹽水注射液1 mL(注射方法同前)，充分活動膝關節(jié)使生理鹽水與關節(jié)液充分混合，再抽取關節(jié)腔生理鹽水沖洗液0.6 mL～1 mL至EP管，4000 r/min離心10 min，取上清，-80℃保存?zhèn)錂z。(3)軟骨采集：用刀片仔細刮除取下股骨內、外側髁表面的關節(jié)軟骨，內側髁軟骨置入裝有RNA保存液的EP管中后保存于-80℃冰箱，留待qPCR檢測，外側髁軟骨置于EP管中后保存于-80℃冰箱，留待Western blot檢測。

1.3 觀察指標及檢測方法

1.3.1血清及關節(jié)液瘦素含量檢測(ELISA法)：采用ELISA法測定血清和關節(jié)液中瘦素含量，操作方法嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.2Ob-Rb mRNA表達檢測(qPCR法)：取股骨內側髁軟骨100 mg，采用RNA提取試劑盒提取總RNA，并用紫外分光光度計測定其純度和濃度。用RNA逆轉錄試劑盒進行反轉錄，合成第一鏈cDNA。qPCR反應條件：50℃ 2 min和95℃ 10 min預變性；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)(收集熒光信號)。所有PCR均做3個復孔，重復3次，結果以2-ΔΔCT表示。qPCR引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequence of qPCR

1.3.3Ob-Rb蛋白表達檢測(Western blot法)：取股骨外側髁軟骨100 mg，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定其濃度和純度，取適量樣品進行SDA-PAGE。蛋白在SDA-PAGE電泳下分離，電轉移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗稀釋液中4℃過夜，洗膜3次，二抗稀釋液中室溫孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑反應1 min，X線曝光。以β-actin作為內參對照，Image J軟件對條帶進行灰度掃描，以目的條帶與β-actin的平均吸光度比值表示蛋白水平，進行半定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組兔血清及關節(jié)液瘦素含量比較

實驗過程中，模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組兔各死亡1只，各組實驗兔最終為空白組8只，其余3組各9只。ELISA檢測結果顯示：模型組和透明質酸鈉組血清瘦素含量較空白組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)，青藤堿組血清瘦素含量顯著低于模型組和透明質酸鈉組，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)；模型組、透明質酸鈉組和青藤堿組關節(jié)液瘦素含量較空白組均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01，P<0.01，P<0.05)，但青藤堿明顯低于模型組和透明質酸鈉組，差異有統(tǒng)計學意義(分別為P<0.01，P<0.05)，見表2。

表2各組兔血清及關節(jié)液瘦素濃度比較(μg/L)
Table2Comparison of levels of leptin in serum and synovium between each group(μg/L)

組別n血清關節(jié)液空白組80.599±0.0230.677±0.100模型組90.759±0.030??1.030±0.124??透明質酸鈉組90.709±0.054?0.935±0.055??青藤堿組90.620±0.129##Δ0.789±0.044? ##Δ

注：與空白組比較，*為P<0.05，**為P<0.01；與模型組比較，#為P<0.05，##為P<0.01；與透明質酸鈉比較，Δ為P<0.05

Note： Compared with control group,*P<0.05,**P<0.01; Compared with model group,#P<0.05,##P<0.01; Compared with HA group,ΔP<0.05.

2.2 各組軟骨Ob-Rb mRNA表達比較

與空白組比較，模型組和透明質酸鈉組Ob-Rb mRNA均呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；青藤堿組Ob-Rb mRNA表達水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；青藤堿組與空白組比較無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組軟骨Ob-Rb mRNA表達水平Fig.1 Expression of Ob-Rb mRNA in cartilage in each group注：與空白組比較，*為P<0.05；與模型組比較，#為P<0.05；與透明質酸鈉比較，Δ為P<0.05Note: Compared with control group, *P<0.05; Compared with model group, #P<0.05; Compared with HA group, ΔP<0.05.

2.3 各組軟骨Ob-Rb蛋白表達比較

模型組Ob-Rb較空白組明顯呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；青藤堿組和透明質酸鈉組顯著低于模型組，有極顯著差異(P<0.01)；青藤堿與空白組及透明質酸鈉組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 各組軟骨Ob-Rb蛋白表達水平Fig.2 Expression of Ob-Rb protein in cartilage in each group注：與空白組比較，**為P<0.01；與模型組比較，##為P<0.01 Note: Compared with control group, **P<0.01; Compared with model group, ##P<0.01.

3 討論

瘦素是由肥胖基因編碼的肽類激素，主要由白色脂肪組織分泌。正常軟骨通常不表達瘦素，而瘦素及Ob-Rb在進行性OA患者軟骨及滑液中的表達顯著提高[4]。研究發(fā)現，關節(jié)液中瘦素濃度與影像學顯示的OA患者關節(jié)破壞程度緊密相關[5]。Simopoulou等[4]觀察了Ob-Rb在體外培養(yǎng)的正常軟骨細胞、OA患者損傷區(qū)軟骨細胞及OA患者損傷鄰近區(qū)軟骨細胞的mRNA及蛋白表達，結果發(fā)現OA軟骨Ob-Rb表達水平顯著高于正常軟骨，嚴重損傷區(qū)軟骨Ob-Rb表達水平明顯高于輕度損傷區(qū)?；|金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一組能夠降解細胞外基質的內肽酶，在OA軟骨基質降解期發(fā)揮重要作用[6]，瘦素可誘導OA關節(jié)軟骨表達MMP-9和MMP-13[7]。研究發(fā)現，瘦素誘導下的人軟骨細胞IL-8的表達量顯著提高[8]，瘦素還可獨立或與IL-1β協(xié)同作用，通過NF-κB、蛋白激酶C和MAP激酶信號通路，上調MMP-1和MMP-3在OA患者軟骨的表達，這一機制與OA患者滑液中高濃度的MMP-1和MMP-3直接相關[9]。

清風藤為防己科藤本植物青藤的藤莖，性味辛、苦、溫，入肝、脾經，具有祛風濕、通經絡等功效。青藤堿是清風藤的主要活性成分。臨床研究表明，青藤堿可緩解OA患者膝關節(jié)疼痛、腫脹及晨僵等癥狀，顯著改善膝關節(jié)功能障礙[10-11]。青藤堿膝關節(jié)腔注射可降低關節(jié)液中TNF-α、IL-1β、IL-6及PGE2含量，延緩軟骨退變進程，提示青藤堿對OA軟骨具有保護作用，其機制可能與其抗炎作用有關[12-14]。

本實驗ELISA結果表明，青藤堿關節(jié)腔注射可顯著降低KOA兔血清及關節(jié)液瘦素水平。軟骨Ob-Rb基因和蛋白表達檢測結果顯示，KOA兔軟骨中Ob-Rb呈高表達，與文獻報道一致，青藤堿關節(jié)腔注射可明顯下調Ob-Rb在軟骨的表達。以上結果提示，降低血清及關節(jié)液瘦素含量以及下調Ob-Rb在軟骨的表達可能是青藤堿關節(jié)腔注射治療OA的機制之一。