陳亞紅，劉早利，王春臺(tái)，劉新瓊

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

水稻廣譜抗性負(fù)調(diào)控基因OsSSI2的克隆及原核表達(dá)

陳亞紅，劉早利，王春臺(tái)，劉新瓊

（中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物技術(shù)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430074）

水稻OsSSI2基因負(fù)調(diào)控水稻的抗病反應(yīng)，為了研究該基因的抗性機(jī)理，構(gòu)建pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21細(xì)胞后利用IPTG誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)并優(yōu)化表達(dá)條件，使用SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)分析表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明：成功構(gòu)建了pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體后進(jìn)行原核表達(dá)，在IPTG濃度為0.3 mmol/L，溫度為25℃，誘導(dǎo)表達(dá)7 h，通過(guò)SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)OsSSI2蛋白的可溶性表達(dá)量最多，為進(jìn)一步研究水稻OsSSI2蛋白的抗性機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

水稻；OsSSI2基因；原核表達(dá)載體；誘導(dǎo)表達(dá)

陳亞紅，劉早利，王春臺(tái)，等.水稻廣譜抗性負(fù)調(diào)控基因OsSSI2的克隆及原核表達(dá)［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，43（4）：33-37.

稻瘟病是由真菌Magnaporthe oryzae 引起的水稻病害，是全球最具影響力和破壞力的水稻病害之一［1］。目前，稻瘟病的防治主要采用化學(xué)防治和抗病新品種培育兩種途徑。化學(xué)防治通常成本高、效果差而且污染環(huán)境。因此發(fā)掘水稻自身的廣譜抗性基因資源，培育持久高抗品種，是最經(jīng)濟(jì)有效的病害控制措施［2-3］，但對(duì)于水稻的廣譜抗性機(jī)理不甚清楚。

植物在抗病過(guò)程中通過(guò)激活不同的防御通路來(lái)對(duì)抗病原體感染，其中水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯（ET）等植物激素是誘導(dǎo)植物抗病反應(yīng)的重要的信號(hào)分子［4-5］。每種激素調(diào)節(jié)不同的防御通路但相互配合。除了植物激素，一些研究也表明脂肪酸（FA）及其衍生物在植物抗病反應(yīng)中也起著重要作用，扮演了一個(gè)重要信號(hào)分子的作用。已經(jīng)有報(bào)道證明，抑制硬脂酰-ACP去飽和酶基因（SACPD）的表達(dá)提高了擬南芥（SSI2）和大豆對(duì)多種病原體的抗性［6-8］。

OsSSI2基因是脂肪酸去飽和基因SSI2在水稻中的同源基因，OsSSI2的RNAi轉(zhuǎn)基因水 稻表現(xiàn)對(duì)稻瘟病及白葉枯的廣譜抗病性，說(shuō)明OsSSI2基因參與并且負(fù)調(diào)控水稻的抗病反應(yīng)［9-13］。因此該基因是研究廣譜抗性機(jī)理的一個(gè)很好材料。本研究以前期得到的水稻OsSSI2基因?yàn)閷?duì)象，構(gòu)建pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體并嘗試不同的表達(dá)條件，得到可溶性GST-OsSSI2融合蛋白，以期為下一步獲取與OsSSI2蛋白相互作用的蛋白及研究該蛋白的抗性機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 　材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原核表達(dá)載體pGEX-6P-1，大腸桿菌菌株BL21和DH5α由中南民族大學(xué)國(guó)家民委生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

限制性內(nèi)切酶BamH I、EcolR I，DNA分子量Marker，購(gòu)自寶生物工程有限公司（大連）；PCR擴(kuò)增酶KOD，連接酶Ligation high都購(gòu)自TOYOBO公司（日本）；Pageruler?Prestained 預(yù)染蛋白分子量Marker購(gòu)自FERMENTAS公司（美國(guó)）；凝膠回收試劑盒、凝膠清潔試劑盒與反轉(zhuǎn)試劑盒均購(gòu)自Axygen公司（美國(guó)）；Anti-GST Antibody 抗體和二抗購(gòu)自天根生化科技有限公司（北京）和Abbkine公司（美國(guó)）；超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購(gòu)自博士德生物公司（武漢）；引物合成及測(cè)序都在金斯瑞生物有限公司（南京）進(jìn)行。

1.2 pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以O(shè)sSSI2質(zhì)粒DNA為PCR擴(kuò)增模板，限制性內(nèi)切酶BamH I、EcoR I為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，利用PCR反應(yīng)擴(kuò)增出目的片段，引物為：

OsSSI26P-1-BamH IF：5'-GATAggatccGCGTC GAGGATGGCGCTCC-3'

OsSSI26P-1-EcoR IR：5'-GCGAgaattcGAGTTG AACTTCCCTACC-3'

(1)大學(xué)生企業(yè)家精神和創(chuàng)業(yè)價(jià)值觀培育情況普遍一般。在對(duì)10所省屬公辦本科高校大學(xué)生創(chuàng)業(yè)教育調(diào)研中發(fā)現(xiàn)只有1所高校大學(xué)生企業(yè)家精神和創(chuàng)業(yè)價(jià)值觀培育情況較好，另外9所高校情況一般；在對(duì)10所湖北省屬民辦本科高校大學(xué)生創(chuàng)業(yè)教育調(diào)研中發(fā)現(xiàn)只有2所高校情況較好，另外8所高校情況一般；而其他3種類(lèi)型的高校在該指標(biāo)上都表現(xiàn)一般。

采用20 μL體系，共3管進(jìn)行PCR反應(yīng)，各反應(yīng)物用來(lái)如下：ddH2O 4.2 μL、2×KOD buffer 1.0 μL、OsSSI26P-1-BamH IF（10 μmol/L）0.6 μL、OsSSI26P-1-EcoR IR（10 μmol/L）0.6 μL、dNTP（2.5 mmol/L）3.2 μL、模板DNA 1.0 μL、KOD 0.4 μL、總體積 20.0 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性15 s，60℃退火30 s，68℃延伸2.0 min，重復(fù)34個(gè)循環(huán)，68℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。使用清潔回收試劑盒對(duì)目的片段進(jìn)行清潔回收，然后用限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I同時(shí)雙酶切目的片段和pGEX-6P1空載體，37℃酶切2 h。使用凝膠回收試劑盒對(duì)酶切的目的片段及載體片段進(jìn)行切膠回收，16℃用Ligation high連接酶連接OsSSI2目的片段和pGEX-6P1載體片段2 h后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂Amp+平板后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)。從平板上隨機(jī)挑取單克隆，提取質(zhì)粒并且進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的單克隆送公司測(cè)序。

1.3 重組蛋白的原核表達(dá)

1.3.1 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將構(gòu)建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重組質(zhì)粒和pGEX-6P1載體轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，涂Amp+平板后于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆菌落接種于3 mL含Amp+的液體 LB培養(yǎng)基中，于37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h作為種子液，按1∶1000的接種量接種至5 mL含Amp+的液體 LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6，保存菌液后加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于37℃振蕩培養(yǎng)3 h誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)。同時(shí)誘導(dǎo)不加IPTG的pGEX-6P1-OsSSI2和pGEX-6P1空載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。

1.3.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 選取上一步中表達(dá)量較好的一個(gè)克隆，用保存的菌液按1∶1000的接種量接種至5 mL含Amp+的液體 LB培養(yǎng)基中，37℃搖床中180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.6后，分別加入IPTG至終濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)確定IPTG濃度后，分別于10、15、25、37℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，分別于1、3、5、7 h誘導(dǎo)時(shí)間取樣5 mL，利用SDS-PAGE電泳檢測(cè)比較誘導(dǎo)溫度和時(shí)間對(duì)可溶性蛋白表達(dá)的影響。

1.3.3 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè) 將誘導(dǎo)表達(dá)完成的菌液轉(zhuǎn)入離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄上清收集菌體，加入3 mL PBS（pH7.4）緩沖液重新懸浮菌體，在冰浴中超聲波破碎細(xì)胞，破碎5 s，間隔5 s，每管破碎10 min，4 000 r/min離心15 min收集蛋白上清，在沉淀中加入1 mL bufferB，室溫靜置1 h，間隔震蕩幾次，12 000 r/min離心15 min，取上清為蛋白沉淀。各取上清100 μL加入適量Loading buffer于100℃沸水中煮10 min，瞬時(shí)離心后進(jìn)行10% SDS-PAGE檢測(cè)。恒壓100 V電泳，用考馬斯亮藍(lán)染色液染色3 h后用脫色液進(jìn)行脫色。

2 　結(jié)果與分析

2.1 pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體的克隆

將重組質(zhì)粒pGEX-6P1-OsSSI2通過(guò)PCR鑒定，OsSSI2大小為1 197 bp（圖1A）；通過(guò)雙酶切鑒定顯示，重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)BamH I和EcoR I雙酶切，得到兩段大小分別為5 000、1 200 bp左右大小的條帶，與預(yù)期估計(jì)條帶大小相同（圖1B）。將構(gòu)建好的載體送公司測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果100%匹配，說(shuō)明pGEX-6P1-OsSSI2原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 重組表達(dá)載體陽(yáng)性克隆鑒定

2.2 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)

將構(gòu)建好的pGEX-6P1-OsSSI2的重組質(zhì)粒和pGEX-6P1載體轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，隨機(jī)挑取6個(gè)單克隆菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)染色和脫色后觀察，目的蛋白大小約為44.4 ku，GST標(biāo)簽大小約為26 ku，所以表達(dá)目的蛋白大小約為70.4 ku，從圖2可見(jiàn)，在70 ku左右，誘導(dǎo)處理后的樣品與空載蛋白存在明顯差異，表明OsSSI2蛋白可能高效表達(dá)，其中2、3、7號(hào)克隆蛋白表達(dá)量較高，可用于下一步蛋白表達(dá)條件摸索。

圖2 含GST標(biāo)簽的OsSSI2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)

利用表達(dá)量較高的克隆進(jìn)行蛋白表達(dá)IPTG濃度的摸索，發(fā)現(xiàn)該蛋白同時(shí)在上清和沉淀都有表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度為0.3 mmol/L時(shí)，上清中可溶性蛋白表達(dá)量最高，因此我們確定IPTG終濃度為0.3 mmol/L（圖3）。

圖3 不同濃度 IPTG誘導(dǎo)pGEX-6P1-OsSSI2蛋白表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)

在蛋白表達(dá)IPTG終濃度為0.3 mmol/L時(shí)，進(jìn)行表達(dá)溫度和時(shí)間的優(yōu)化，經(jīng)過(guò)10、15、25、37℃不同溫度，1、3、5、7 h不同時(shí)間的摸索，確定25℃、7 h為最佳表達(dá)條件（圖4）。

圖4 不同溫度時(shí)間誘導(dǎo)pGEX-6P1-OsSSI2蛋白表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)

綜上所述，確定目的蛋白較適宜的誘導(dǎo)表達(dá)條件為：IPTG終濃度為0.3 mmol/L、誘導(dǎo)溫度和時(shí)間為25℃、7 h。

2.3 重組蛋白的Western Blot檢測(cè)

用GST單抗對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白孵育進(jìn)行檢測(cè)，可以觀察到在20 ku和35 ku之間空載體及誘導(dǎo)后重組蛋白均有，分析該條帶為GST條帶。在70 ku附近，誘導(dǎo)處理后的pGEX-6P1-OsSSI2上清、沉淀中均出現(xiàn)單一的信號(hào)條帶，而未加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-6P1-OsSSI2和空載體的蛋白樣品中未見(jiàn)信號(hào)表達(dá)（圖5）。此結(jié)果進(jìn)一步表明載體構(gòu)建成功，水稻OsSSI2蛋白成功并高效的表達(dá)，并且該外源蛋白有可溶性和包涵體兩種表達(dá)形式。

圖5 OsSSI2蛋白Western Blot檢測(cè)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用pGEX-6P1原核表達(dá)載體，在目標(biāo)蛋白的N端加上一個(gè)約26 ku的GST標(biāo)簽蛋白，在原核表達(dá)時(shí)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，從不同的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間去摸索，結(jié)果在表達(dá)條件為IPTG終濃度為0.3 mmol/L、誘導(dǎo)溫度為25℃、誘導(dǎo)時(shí)間為7 h時(shí)提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)，為進(jìn)一步去研究OsSSI2蛋白在水稻中的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。

在原核細(xì)胞表達(dá)外源基因過(guò)程中，尤其是以大腸桿菌為宿主菌高效表達(dá)外源基因時(shí)，表達(dá)蛋白常常在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集，形成包涵體。以包涵體形式存在的蛋白質(zhì)分子不具有正確的天然三維結(jié)構(gòu)，表達(dá)蛋白不具有生物活性，需要通過(guò)復(fù)性操作以得到具有預(yù)期生物活性的蛋白質(zhì)。而通常的包涵體復(fù)性過(guò)程中，復(fù)性條件難以控制，成本高，在復(fù)性過(guò)程中也很難保證包涵體蛋白形成正確的折疊結(jié)構(gòu)，為后續(xù)的研究提供了諸多的不便［18-19］。外源表達(dá)OsSSI2蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)目的蛋白仍然以部分包涵體形式存在，而如果能從上清中表達(dá)出大量可溶性的OsSSI2蛋白則會(huì)避免這個(gè)問(wèn)題，于是在原核表達(dá)時(shí)優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件，最終提高了目的蛋白的可溶性表達(dá)。

本研究室在前期研究中，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)初步篩選到與OsSSI2蛋白互作的潛在的互作蛋白，為了進(jìn)一步研究其互作關(guān)系，本研究克隆該目的基因并利用原核表達(dá)成功表達(dá)出可溶性目的蛋白，下一步將進(jìn)行兩個(gè)互作蛋白體外Pull-down的驗(yàn)證，這對(duì)其抗病機(jī)理的研究具有重要意義。

［1］Kush G S，Jena K K.Current status and future prospects for research on blast resistance in rice（Oryza sativa L.）［M］.Advances in Genetics，Genomics and Control of Rice Blast Disease.Springer Netherlands，2009（2）：1-10.

［2］McDowell J M，Woffenden B J.Plant disease resistance genes：recent insights and potential applications［J］.Trends in Biotechnology，2003，21（4）：178-183.

［3］Baker B，Zambryski P，Staskawicz B，et a1.Signaling in plantmicrobe interactions［J］.Science，1997，276：726-733.

［4］Kachroo A，Kachroo P.Salicylic acid，jasmonic acidand ethylene mediated regulation of plant defense signaling［J］.Genet Eng（N.Y.），2007（2）：55-83.

［5］Durrant W，Dong X.Systemic acquired resistance［J］.Phytopathol，2004，42：185-209.

［6］Dong X.NPR1，all things considered［J］.Plant Biology，2004（7）：547-552.

［7］Bostock R M.Signal crosstalk and induced resistance：straddling the line between cost and benefit［J］.Annu Rev Phytopathol，2005，43：545-580.

［8］Chang J，Masaki S，Satoru M，et al.Suppression of the rice fatty-acid desaturase gene OsSSI2 enhances resistance to blast and leaf blight diseases in rice［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2009（22）：820-829.

［9］Vergne E，Ballini E，Marques S，et al.Early and specific gene expression triggered by rice resistance gene Pi33 in response to infection by ACE1 avirulent blast fungus［J］.New Phytol，2007，174：159-171.

［10］Shimono M，Sugano S，Nakayama A，et al.Rice WRKY45 plays a crucial role in benzothiadiazoleinducible blast resistance［J］.Plant Cell，2007（19）：2064-2076.

［11］Kachroo P，Kachroo A，Lapchyk L，et al.Restoration of defective cross talk in ssi2 mutants：role of salicylic acid，jasmonic acid，and fatty acids in SSI2-mediated signaling［J］.Plant-Microbe Interact，2003（16）：1022-1029.

［12］Chandra S，Venugopal S，BarmanS，et al.Plastidial fatty acid levels regulate resistance gene-dependent defense signaling in Arabidopsis［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2007，104：7277-7282.

［13］Shah J，Kachroo P，Nandi A，et al.A recessive mutation in the Arabidopsis SSI2 gene confers SA and NPR1-independent expression of PR genes and resistance against bacterial and oomycete pathogens ［J］.Plant Journal，2001（25）：563-574.

［14］Zhen L，Xing Z L，Peng Y，et al.Orthogonal optimization of prokaryotic expression of a natural snake venom phospholipase A2 inhibitor from Sinonatrix annularis［J］.Toxicon，2015，108：264-271.

［15］Kou J X，Zhao G H，Wei Q K，et al.Cloning，prokaryotic expression and immunological identification of Toxoplasma surface antigen IMP1［J］.Chinese Journal of Schistosomiasis Control，2015，27（3）：285-289.

［16］劉洋，王春臺(tái)，劉學(xué)群，等.水稻VDAC3蛋白的可溶性外源表達(dá)及純化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42 （13）：3815-3818.

［17］劉新瓊，徐瑋玉，劉早利，等.水稻OsAAA1蛋白的原核表達(dá)載體構(gòu)建及其可溶性表達(dá)研究［J］.中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，34（2）：18-21.

［18］包義風(fēng)，應(yīng)蓬芳，蔣琳.包涵體蛋白復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2012（2）：84-88.

［19］趙喜紅，何小維，李文美，等.大腸桿菌表達(dá)包涵體蛋白體外復(fù)性研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2010（6）：379-383.

（責(zé)任編輯 楊賢智）

Cloning and prokaryotic expression of broad-spectrum resistance negative control gene OsSSI2 from rice

CHEN Ya-hong，LIU Zao-li，WANG Chun-tai，LIU Xin-qiong
（Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China/Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission /College of Life Science，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China）

The rice OsSSI2 gene regulates negatively rice disease resistance.In order to dissect the resistance mechanism of OsSSI2，the recombinant prokaryotic expression vector pGEX-6P1-OsSSI2 was constructed and transformed into E.coli strain BL21.The OsSSI2 protein was induced with IPTG，and confirmed by SDS-PAGE and Western Blot analysis.The results revealed that the prokaryotic expression vector pGEX-6P1-OsSSI2 was constructed and expressed successfully.In the condition that IPTG concentration was 0.3 mmol/L，the temperature was 25℃，and the time induced expression was 7 h，maximum expression of OsSSI2 soluble protein was detected by SDS-PAGE and Western Blot，which laid the foundation for further research of resistance mechanism of OsSSI2 protein from rice.

rice；OsSSI2；prokaryotic expression vector；induced expression

S511.01

A

1004-874X（2016）04-0033-05

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.04.008

2015-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金（31370306）；湖北省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2013CFA098）

陳亞紅（1989-），女，在讀碩士生，E-mail：896826843@qq.com

劉新瓊（1972-），女，博士，教授，E-mail：liuxinqiong@mail.scuec.edu.cn