盧金輝劉榮建祖旺春劉瑞張雪峰（. 原子高科股份有限公司，北京 0243；2.中國原子能科學(xué)研究院，北京 0243）

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血管緊張素Ⅰ放射免疫分析方法（固相抗體法）的建立

盧金輝1，2劉榮建1，2祖旺春1劉瑞1張雪峰1，2
（1. 原子高科股份有限公司，北京 102413；2.中國原子能科學(xué)研究院，北京 102413）

【摘要】目的：采用固相抗體包被方法，建立血管緊張素Ⅰ放射免疫分析方法。方法：通過對抗體包被步驟、抗體稀釋濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)體積等條件進(jìn)行選擇，建立新的分析方法，并進(jìn)行方法學(xué)鑒定。結(jié)果：本項(xiàng)工作所建立的分析方法測量范圍為100-7800pg/ml，靈敏度為42.2 pg/ml。批內(nèi)、批間變異均小于10%，回收率為90.3%—102.2%。結(jié)論：本項(xiàng)工作所建立的固相抗體方法與原有分離試劑分析方法相比，具有操作步驟少、反應(yīng)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，更加方便臨床檢測。

【關(guān)鍵詞】血管緊張素Ⅰ 固相抗體法 放射免疫分析

1 引言

采用固相抗體包被聚苯乙烯試管，并對抗體包被條件進(jìn)行了研究，建立了血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法。結(jié)果表明在2—8℃下過夜包被，抗體滴度在1：9萬 時(shí)，制備的包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，結(jié)合達(dá)到最大；不同滴度下包被，包被溫度和時(shí)間對制備的包被管的影響不同；不同的反應(yīng)時(shí)間以及125I—AI和標(biāo)準(zhǔn)品加樣量的不同也會(huì)對包被管的結(jié)合產(chǎn)生影響。血管緊張素Ⅰ包被管法放射免疫分析靈敏度為（42.2Pg/ml）；回收率為（90.3%—102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%—9.0%）和（8.3%—10.2%）。

2 實(shí)驗(yàn)材料

血管緊張素Ⅰ多克隆抗體由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；聚苯乙烯六角試管（mm×mm）為（哪個(gè)）塑料廠產(chǎn)品；125I—AI及AI藥盒標(biāo)準(zhǔn)品由原子高科醫(yī)學(xué)二部提供；蛋白G填料親合層析柱由美國進(jìn)口；牛血清白蛋白（BSA）為上海生物制品廠產(chǎn)品。對照藥盒由原子高科股份有限公司生產(chǎn)（國藥準(zhǔn)字：）。其他試劑均為分析純。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 兔IgG的純化

采用蛋白—G柱進(jìn)行親合層析純化，純化后IgG濃度由紫外分光光度法測定。

用包被緩沖液（0.1M PH9.5碳酸緩沖液）將兔IgG配制10μg /ml?；旌暇鶆蚝?50μL /管包被，然后放2—8℃過夜，棄去包被管中第一層包被液，各管用500μL洗滌液（0.02 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第二層（兔二抗）用。

3.2 用驢抗兔二抗進(jìn)行第二層包被

表1　 不同滴度的抗體包被實(shí)驗(yàn)

表2　 包被溫度和包被時(shí)間對抗體包被的影響

表3　反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對免疫分析的影響（總T為：32801cpm/min）

表4　 加樣量對免疫分析的影響

表5　 回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 單位pg/ml

表6　 批內(nèi)與批間重復(fù)性

表7　健全性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （此處可以不列表，直接說）

用0.05 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液（含1%BSA）將兔二抗配成合適的濃度后250μL/管包被，然后放2—8℃過夜，棄去包被管中第二層包被液，各管用500μL洗滌液（0.02 mol/μL，pH7.4磷酸緩沖液）清洗1次。待包被第三層（兔一抗）用。

3.3 不同滴度兔抗（一抗）包被實(shí)驗(yàn)

將兔抗用封閉液配制成1：2萬，1：4萬，1：6萬，1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬，1：16萬不同的滴度，分別加250μL于已經(jīng)包有兔二抗的包被管中，每個(gè)滴度做雙復(fù)管，之后在每管中加入100μL125I—AI，然后放2—8℃靜置過夜；棄去管中溶液，各管用500L洗滌液清洗3次后測量各管放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算其結(jié)合率，選擇合適的抗體滴度作為工作稀釋度。

3.4 溫度，時(shí)間對抗體包被的影響

用封閉液將兔抗（一抗）稀釋成不同滴度（1：2萬，1：4萬， 1：8萬，1：9萬，1：12萬，1：14萬），分別在不同溫度和時(shí)間下包被，實(shí)驗(yàn)中抗體加入體積均為250μL，各管均加入100μL125I—AI，將不同條件下制備的包被管進(jìn)行放射免疫結(jié)合分析，并對結(jié)果進(jìn)行比較。

3.5 抗體包被管的制備

每管加250μL兔IgG溶液（10μg /ml），2—8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次后加入250μL驢抗兔二抗溶液，2 —8℃靜置過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次后加入250μ L兔一抗溶液（1：9萬），2—8℃過夜，棄溶液，各管加500μL洗滌液清洗1次，棄溶液，自然晾干，密閉，于2—8℃下保存。

3.6 體系反應(yīng)時(shí)間，溫度的選擇

設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)條件為37℃1h，37℃3h，4℃15h，4℃24h。

3.7 加樣量的選擇

設(shè)計(jì)4組不同的加樣量為：第一組125I—AI加100μL，標(biāo)準(zhǔn)品加100μL；第二組：125I—AI加100μL，標(biāo)準(zhǔn)品加50μL；第三組125I—AI 加50μL，標(biāo)準(zhǔn)品加100μL；第四組125I—AI加50μL，標(biāo)準(zhǔn)品加50μ L。

3.8 放射免疫分析程序

標(biāo)準(zhǔn)品（或樣品、質(zhì)控血清）100μL和標(biāo)記物100μL加于包被管中，混勻，然后放2—8℃靜置過夜（15—24h），棄溶液，加500μL洗滌液清洗2—3次，測各管放射性計(jì)數(shù)。

3.9 方法學(xué)考核

靈敏度：以20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)管的計(jì)數(shù)平均值—2S對應(yīng)的劑量值表示。準(zhǔn)確度：任取一份血漿標(biāo)本，測定基值后分別加入0pg/ml，250pg/ml，625 pg/ml，1560 pg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品，再次測定，計(jì)算回收率。精密度：測定批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV%）。健全性：將一份高濃度樣品稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64分別測定其含量。經(jīng)回歸處理后成一條直線，y=1.000 x +0.4673，r=1.000。

4 結(jié)果與討論

4.1 不同滴度的兔抗（一抗）包被實(shí)驗(yàn)

不同滴度抗體包被實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表1，表1結(jié)果表明，當(dāng)抗體滴度為1：16萬—1：8萬時(shí)，隨著抗體滴度的減小，包被管的結(jié)合率逐步升高；當(dāng)抗體滴度為1：8萬—1：2萬時(shí)，包被管的結(jié)合率沒有出現(xiàn)明顯升高，基本保持同一水平。所以在不影響放免藥盒靈敏度的前提下，選擇1：9萬作為抗體的工作稀釋度，用于包被。（該處可以作圖，不列表）

4.2 包被時(shí)間，包被溫度對包被的影響

結(jié)果列于表2由表2可知，包被溫度和包被時(shí)間對包被管免疫結(jié)合的影響依賴于包被時(shí)加入抗體的濃度。當(dāng)加入抗體的滴度為1：2萬和1：4萬時(shí)，升高包被溫度使包被管的免疫結(jié)合增加，而延長包被時(shí)間對包被管的免疫結(jié)合無顯著影響；當(dāng)加入抗體滴度為1：14萬和1：16萬時(shí)，升高包被溫度包被管的免疫結(jié)合顯著減少，原因可能是抗體在低濃度時(shí)較不穩(wěn)定，包被過程中較高的溫度使抗體的活性損失；當(dāng)加入抗體滴度為1：8萬和1：9萬時(shí)，包被溫度對包被管的免疫結(jié)合影響減少，且包被時(shí)間從3h延長到24h，包被管的免疫結(jié)合有所增加。此結(jié)果提示，在較高溫度下，采用較大抗體濃度，只需要較短的包被時(shí)間，即可獲得具有較高免疫結(jié)合的抗體包被管。但考慮到實(shí)際生產(chǎn)中低成本和包被工藝簡便性的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇抗體滴度為1：9萬，2—8℃過夜（15—24h）作為包被條件。

4.3 體系反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度的選擇

結(jié)果列于表3，由表3可知，當(dāng)反應(yīng)溫度在37℃時(shí)，延長反應(yīng)時(shí)間從1 h到3 h，免疫分析的最大結(jié)合S0%從46.4%增加到59.2%，但是標(biāo)準(zhǔn)曲線的最高濃度點(diǎn)的抑制不好，分別為37℃1 h為16.1%；37℃3 h為14.6%，這可能是反應(yīng)不充分造成的。而反應(yīng)溫度在2—8℃時(shí)，延長反應(yīng)時(shí)間從15—24h，免疫反應(yīng)的幾個(gè)指標(biāo)都比較好，同時(shí)也克服了37℃反應(yīng)曲線抑制不好的問題，所以在考慮實(shí)際操作簡便，節(jié)省時(shí)間的需要，在滿足免疫分析要求的前提下，選擇反應(yīng)條件為2—8℃過夜。

4.4 加樣量對免疫分析的影響

結(jié)果列于表4由表4可知，當(dāng)加入標(biāo)記物的量都是50μL時(shí)，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都好于加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品的包被管免疫分析主要指標(biāo)，加50μ L標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的曲線抑制不好，標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度點(diǎn)的B/B0% 為94.1%，最高濃度點(diǎn)的B/B0%為14.6%。但是考慮到加50μL標(biāo)記物的各管計(jì)數(shù)都比較低，還有計(jì)數(shù)器的效率等問題，所以標(biāo)記物的加樣量就不采用50μL加樣。當(dāng)加入標(biāo)記物的量都是100μL時(shí)，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品的包被管的免疫分析主要指標(biāo)最大結(jié)合S0%，曲線的抑制都很好，并且各管的放射性計(jì)數(shù)也比較高，各種因素對測量的影響也相對較小。當(dāng)加入50μL標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線出現(xiàn)倒勾現(xiàn)象，曲線的最低濃度點(diǎn)B/B0%為101%，出現(xiàn)這種情況就是因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的各包被管中加入 的非標(biāo)記抗原的量不夠造成的。所以通過對數(shù)據(jù)的比較，選擇比較合適的加樣量為標(biāo)記物加100μL，標(biāo)準(zhǔn)品加100μL。

4.5 血管緊張素Ⅰ放射免疫分析（固相法）標(biāo)準(zhǔn)曲線

血管緊張素Ⅰ放射免疫分析（固相法）標(biāo)準(zhǔn)曲線示于圖1。

4.6 方法學(xué)鑒定

（1）靈敏度。以20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)管計(jì)數(shù)的平均值-2S對應(yīng)的劑量值表示，靈敏度為（42.2Pg /ml）pg/ml。

（2）準(zhǔn)確度。已知量的一份血漿樣品中分別加入4種不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，結(jié)果列于表5。由表5可知本法回收率為90.3%—102.2%，說明本法準(zhǔn)確性較好。

（3）精密度。采用本方法對3份含有不同濃度的人血漿樣品重復(fù)測定，計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)，結(jié)果列于表6。由表6可知，批內(nèi)變異系數(shù)為（5.1%—9.0%）；批間變異系數(shù)為（8.3%—9.5%）。

（4）健全性（同質(zhì)性）。將一份較高濃度的血漿樣品倍比稀釋成1：1、1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64，測定結(jié)果列于表7。由表中數(shù)據(jù)計(jì)算其相關(guān)方程為：y=1.000 x +0.4673，r=1.000

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明研制的血管緊張素Ⅰ放射免疫分析法（固相抗體法）的健全性良好。

5 結(jié)語

（1）采用固相抗體包被聚苯乙烯試管的包被條件為：選擇抗體滴度為1：9萬，2—8℃過夜（15—24h）。在此條件下所得包被管用于血管緊張素Ⅰ放射免疫分析，可達(dá)到最大結(jié)合。

（2）用該包被管進(jìn)行血管緊張素Ⅰ放射免疫分析時(shí)，其靈敏度為（42.2Pg /ml）；回收率為（90.3%—102.2%）；批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為（5.1%—90%）和（8.3%—10.2%）。

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