饒華春，滕繼云，刁　勇，宋沁馨，王立強(qiáng)，楊會勇*，周國華

(1.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院分子藥物研究院，教育部分子藥物研究中心，福建泉州362021；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，江蘇南京210002；3.中國藥科大學(xué) 藥物分析教研室，藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

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Tm值差異型不對稱PCR方法的建立及其在分子診斷中的應(yīng)用

饒華春1，滕繼云1，刁勇1，宋沁馨2,3，王立強(qiáng)1，楊會勇1*，周國華2*

(1.華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院分子藥物研究院，教育部分子藥物研究中心，福建泉州362021；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院藥理科，江蘇南京210002；3.中國藥科大學(xué) 藥物分析教研室，藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210009)

摘要：多數(shù)分子診斷方法對靶基因的檢測都是以單鏈DNA為基礎(chǔ)的，如何獲得大量和高質(zhì)量的單鏈靶DNA分子一直是研究熱點(diǎn).以包含BRCA1基因上3個單核苷酸多態(tài)性(SNP)的DNA片段為研究對象，通過調(diào)整不對稱擴(kuò)增引物堿基序列組成(5′-端引入錯配或加入鎖核苷酸(locked nucleic acid，LNA))，使用相差10倍濃度來增加不對稱引物間Tm值差異，改進(jìn)擴(kuò)增條件(添加增強(qiáng)劑的擴(kuò)增緩沖液，不同退火溫度的二階循環(huán)擴(kuò)增程序)后，進(jìn)行不對稱擴(kuò)增來產(chǎn)生大量單鏈靶DNA產(chǎn)物.結(jié)果表明Tm差異型不對稱PCR(Tm difference asymmetric PCR,TDA-PCR)可有效提高單鏈DNA分子產(chǎn)率，降低引物設(shè)計(jì)難度，也擴(kuò)大了模板序列的適用范圍.此外，還針對禽流感病毒H5N1的血凝素(haemagglutinin)HA基因保守序列進(jìn)行不對稱擴(kuò)增，用獲得的單鏈DNA為模板進(jìn)行焦磷酸測序檢測，所得結(jié)果與參考序列一致且無明顯干擾信號.因此，采用Tm值差異型不對稱PCR可使焦磷酸測序等分子診斷流程更為簡便,成本更低,效率更高，具有很好的通用性和實(shí)用性.

關(guān)鍵詞：Tm值差異型不對稱PCR；單鏈DNA模板；單核苷酸多態(tài)性；焦磷酸測序；禽流感病毒

如何針對諸如糖尿病、心血管疾病、腫瘤等難治性疾病進(jìn)行防治是當(dāng)前醫(yī)藥工作領(lǐng)域面臨的迫切難題.目前針對這些難治性疾病的研究越來越多，新的機(jī)制和理論不斷被提出，總的認(rèn)識是這些疾病均與人類基因相關(guān)，在一定程度上可以說這些疾病均屬于分子疾病.因此闡明這類疾病的分子機(jī)制成為有針對性制定治療方案的前提條件.以人類疾病相關(guān)基因序列的檢測與功能研究為主要任務(wù)之一的分子診斷學(xué)，可為這些疾病的分子機(jī)制研究提供方法和積累數(shù)據(jù).其中焦磷酸測序是當(dāng)前分子診斷較為常用的手段，是一種短片段DNA分析檢測的理想平臺.焦磷酸測序是基于DNA合成延伸反應(yīng)的測序技術(shù)[1-2]，不需要電泳和熒光標(biāo)記，可實(shí)時分析測序引物相鄰的堿基序列，目前已在分子診斷中如基因特異位點(diǎn)檢測[3-4]和大規(guī)模測序[5-6]、疾病相關(guān)基因檢測[7-8]、病原微生物快速檢測與確定[9]等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用.因此本研究選擇焦磷酸測序技術(shù)來檢測通過優(yōu)化前后不對稱擴(kuò)增獲得的單鏈DNA樣本制備質(zhì)量，并分析其在分子診斷中的應(yīng)用效果.

單鏈DNA樣品的獲取是眾多分子診斷技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一[1]，如探針雜交[10]、實(shí)時熒光定量PCR[11]、適體篩選[12]、生物傳感器[13-14]、疾病診斷與檢測[15]，甚至用于基因表達(dá)調(diào)控[16].單鏈DNA樣品質(zhì)量直接關(guān)系到以上述檢測平臺為基礎(chǔ)的檢測與研究結(jié)果的分析和效果評價.目前單鏈DNA樣品制備主要采用微球捕獲法[1,17]，此方法可獲得單一的單鏈產(chǎn)物，但制備步驟繁瑣，易發(fā)生交叉污染.一般不對稱PCR被認(rèn)為可以產(chǎn)生大量單鏈DNA樣品，但是很多時候擴(kuò)增效率并不穩(wěn)定.指數(shù)線性PCR(linear-after-the-exponential-PCR，LATE-PCR)技術(shù)針對一般不對稱PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，將引物及擴(kuò)增產(chǎn)物Tm計(jì)算引入到不對稱PCR實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中[18-21],還發(fā)展為可高效率制備用于焦磷酸測序及其他分子診斷平臺的單鏈寡核苷酸分子[22-24]，可以說LATE-PCR是一種Tm值差異型不對稱擴(kuò)增PCR.但是LATE-PCR要高效產(chǎn)生單鏈核苷酸分子，需限制性引物(PL)的Tm值(melting temperature of the limiting primer，TmL)、大量引物(PX)的Tm值(melting temperature of the excess primer，TmX)和擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值(melting temperature of double-stranded amplicon，TmA)滿足TmL-TmX≥5 ℃和TmA-TmX≤13 ℃這2個條件[23,25].經(jīng)過分析和實(shí)驗(yàn)表明，對于很多富含AT堿基的序列以及較長的目的片段，LATE-PCR的引物設(shè)計(jì)將變得十分困難[22-23].

本研究通過分析不對稱擴(kuò)增體系中引物和擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值，研究其與擴(kuò)增效率和擴(kuò)增特異性的關(guān)系，通過提高大量引物的Tm值，降低限制性引物的Tm值，優(yōu)化引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增程序，期望提高長片段和富含AT堿基的DNA片段單鏈產(chǎn)生效率，并有效簡化焦磷酸測序等分子診斷方法的操作流程，建立一種低運(yùn)行成本的單鏈DNA模板制備的Tm值差異型不對稱擴(kuò)增(TDA-PCR)新方法.選擇BRCA1基因中3個與乳腺癌相關(guān)單核苷酸多態(tài)性(SNP1～3)[22,26-27]和rs2270517(SNP4)[28]的DNA片段為研究對象，通過對比LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法的單鏈擴(kuò)增效率和焦磷酸測序結(jié)果，對其單鏈模板制備效果進(jìn)行考察；同時采用TDA-PCR法制備禽流感HA基因單鏈模板并進(jìn)行焦磷酸測序檢測，以考察其對實(shí)際樣品的檢測效果以及在不同焦磷酸測序系統(tǒng)中的通用性.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

EDC-810基因擴(kuò)增儀(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；PowerPac1000高壓電源(美國BIO-RAD公司)；GenGenius凝膠電泳成像儀(美國Syngene公司)；CUV-紫外透射儀(美國Bioimage公司)；焦磷酸測序裝置由本實(shí)驗(yàn)室按文獻(xiàn)[29]自行組裝完成；R6335光電倍增管(日本Hamamatsu Photonics K.K.公司)；BPCL微弱發(fā)光測量儀(中國科學(xué)院生物物理研究所)；N2000色譜工作站(浙江大學(xué)智達(dá)信息工程有限公司)；PSQ96焦磷酸測序儀器(瑞典Pyrosequencing AB 公司).

TaqDNA 聚合酶、dNTPs(10 mmol/L)、10×Buffer(不含Mg2+)、MgCl2購自TaKaRa公司(大連寶生物工程有限公司)；FastStarTaqDNA聚合酶購自Roche公司(上海羅氏制藥有限公司)；乙烯基吡咯烷酮(PVP)、重組熒光素酶購自美國Promega公司；牛血清白蛋白(BSA)、 5′-磷酸化硫酸腺苷(APS)和 Apyrase 購自美國Sigma公司；α-硫化脫氧三磷酸腺苷(dATPαS)、dGTP、dTTP和dCTP 購自Amersham Pharmacia Biotech公司.ATP硫化酶、Klenow 片段(無外切酶活性)由本實(shí)驗(yàn)室表達(dá).所用其他化學(xué)試劑均為分析純，所有試劑均用去離子水稀釋.

本研究所用的血樣由本實(shí)驗(yàn)室健康志愿者提供，分別編號為g-1和 g-2.血樣樣品的基因組DNA按照酚-三氯甲烷法提取.以BRCA1基因上3個乳腺癌相關(guān)SNPs和rs2270517為對象，分別標(biāo)記為SNP1、SNP2、SNP3、SNP4.禽流感病毒H5N1的基因組DNA從江蘇省疾病控制中心獲得.

本研究所涉及的核苷酸片段序列均來自NCBI網(wǎng)站(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)，包含rs2270517 位點(diǎn)相關(guān)序列(AC104581.22)、3個BRCA1基因的SNPs相關(guān)序列(NT_010755.15)、禽流感病毒H5N1的HA基因序列(CY098853.1)；引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0軟件，Tm值計(jì)算采用在線軟件Oligo Analyzer 3.0 (http:∥scitools.idtdna.com/calc/analyzer，參數(shù)按實(shí)際值輸入，如一價陽離子濃度50 mmol/L，PX濃度為1 μmol/L，PL濃度為0.1 μmol/L)；鎖核甘酸(LNA)修飾的引物設(shè)計(jì)采用Exiqon公司的在線LNA設(shè)計(jì)和分析工具(http:∥lna-tm.com/).LNA修飾的引物由TaKaRa公司合成，其他引物均由Invitrogen公司(上海英駿生物有限公司)合成.

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序

反應(yīng)體系總體積25 μL，包括：3 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTPs、1.5 UTaqDNA 聚合酶、1 mmol/L引物PX、100 nmol/L引物PL、2.5 μL 10×PCR buffer(50 mmol KCl、 15 mmol Tris-HCl、 pH 8.0)、13%(體積分?jǐn)?shù))甘油、0.48%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA.

PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min;87 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；87 ℃ 10 s，66 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；16 ℃維持.其中第一擴(kuò)增循環(huán)的退火溫度比TmL低1～2 ℃，第二擴(kuò)增循環(huán)比TmX的低1～2 ℃.采用2%～3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，染料為Goldview(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)，用量5 μL/100 mL.

1.2.2PCR產(chǎn)物電泳條帶面積與強(qiáng)度檢測

將PCR產(chǎn)物電泳圖在ImageJ軟件打開，改變圖片的類型，降低背景的影響；在每個泳道選定待分析的目的條帶，選擇相同大小的區(qū)域進(jìn)行分析，生成曲線圖；對特定條帶進(jìn)行積分計(jì)算，得該區(qū)域的積分面積后，計(jì)算此部分條帶的強(qiáng)度.

1.2.3單鏈模板制備及焦磷酸測序

焦磷酸測序模板的制備和焦磷酸測序過程均按照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行，包括反應(yīng)液配制、PCR產(chǎn)物處理、焦磷酸測序3個步驟.

2結(jié)果與討論

2.1TDA-PCR反應(yīng)效率分析與條件優(yōu)化

2.1.1TDA-PCR反應(yīng)機(jī)理分析

相對于普遍使用的微球捕獲法，不對稱PCR曾被認(rèn)為是制備DNA單鏈分子較為理想的方法，但其產(chǎn)生單鏈DNA產(chǎn)物的效率很低[18]，因?yàn)樵谥笖?shù)擴(kuò)增階段，限制性引物的消耗降低了其與模板的退火效率，而使線性擴(kuò)增階段用來擴(kuò)增模板數(shù)量較少；在線性擴(kuò)增階段，不斷增多的單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物與大量引物競爭性結(jié)合擴(kuò)增模板，導(dǎo)致單鏈產(chǎn)生效率降低.LATE-PCR方法注意到了引物濃度變化對Tm值的影響[18]，發(fā)現(xiàn)只有滿足TmL-TmX≥0 ℃和TmA-TmX≤18 ℃2個條件才能獲得較好的單鏈擴(kuò)增效率[25].而在已報道的用于焦磷酸測序的LATE-PCR反應(yīng)中，這個條件進(jìn)一步被優(yōu)化成TmL-TmX≥5 ℃和TmA-TmX≤13 ℃[23]；但依據(jù)這個條件，濃度低的引物需要較高的Tm值，因此要擴(kuò)增較長的靶片段或引物退火區(qū)域富含AT堿基的靶序列，引物設(shè)計(jì)十分困難，這限制了LATE-PCR的應(yīng)用范圍.

為了解決這個問題，在充分研究LATE-PCR反應(yīng)機(jī)制的基礎(chǔ)上，嘗試并逐步改進(jìn)這種不對稱擴(kuò)增方法，改變LATE-PCR中PX和PL的濃度比值，PX采用高濃度而PL采用低濃度.從表1可以看出：同樣序列的引物，按照LATE-PCR計(jì)算TmL-TmX的值多在1～3 ℃，而在TDA-PCR體系中其值則可達(dá)5～10 ℃.在指數(shù)擴(kuò)增階段，TDA-PCR采用低溫退火溫度(比TmL低1～2 ℃)和充分的循環(huán)反應(yīng)來增加PL的退火效率和反應(yīng)效率.由于PX的Tm值較高，理論上非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險將增加，本研究通過優(yōu)化PCR增強(qiáng)劑配比以及改進(jìn)擴(kuò)增反應(yīng)程序克服了這一問題.在線性擴(kuò)增階段，擴(kuò)增產(chǎn)物與引物PX仍會競爭結(jié)合擴(kuò)增模板，則TmA-TmX≤13 ℃仍是高效率擴(kuò)增單鏈的必要條件；但在TDA-PCR中，PX因濃度高，TmX比LATE-PCR中更易接近TmA，引物設(shè)計(jì)時相對容易，相同條件下，對長片段有較高的單鏈擴(kuò)增效率.

2.1.2TDA-PCR的引物設(shè)計(jì)與PCR條件的優(yōu)化

為了能使限制性引物有效地與模板退火，本研究選取了先低溫(比TmL低3～5 ℃)、后高溫(比TmX低1～2 ℃)的擴(kuò)增程序；先使PL在線性擴(kuò)增基本消耗完全，再在線性擴(kuò)增階段增高溫度以增加反應(yīng)特異性，且使Tm值低的PL無法再與模板退火，從而產(chǎn)生大量單鏈產(chǎn)物.有關(guān)循環(huán)數(shù)的選擇，LATE-PCR方法在指數(shù)循環(huán)階段選擇25個循環(huán)[25]，本研究對循環(huán)數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在所建立的TDA-PCR反應(yīng)中30個循環(huán)效果更好；根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)TaqDNA聚合酶在55個循環(huán)后還有一半活性，通過降低變性溫度和增添PCR增強(qiáng)劑來保持其活性，線性擴(kuò)增階段反應(yīng)也優(yōu)化為30個循環(huán).

為了進(jìn)一步優(yōu)化擴(kuò)增效率，本研究在引物設(shè)計(jì)中還引入了可有效增加Tm值的LNA.LNA是新型的核酸類似物，適用于所有的4種核苷酸，且能夠顯著提高雙鏈穩(wěn)定性.研究認(rèn)為寡核苷酸序列中每增加1個單體LNA分子將使Tm升高2～8 ℃[30]，而引物與模板結(jié)合的特異性卻不會因?yàn)閴A基數(shù)增加而降低，因此特別適合TDA-PCR反應(yīng).本文所設(shè)計(jì)的LNA修飾引物長度和相應(yīng)Tm值見表1.

2.1.3TDA-PCR的單鏈擴(kuò)增效率分析

為了驗(yàn)證LATE-PCR和本研究所建立的TDA-PCR方法對不同片段的擴(kuò)增效率，設(shè)計(jì)了包含不同SNP位點(diǎn)的不同長度DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖1(2%瓊脂糖凝膠，Goldview熒光染料).該熒光染料結(jié)合單鏈呈現(xiàn)淡紅色，結(jié)合雙鏈為綠色.從結(jié)果可以看出，對于不同長度目的片段的擴(kuò)增，TDA-PCR產(chǎn)物可以看到綠色雙鏈條帶和淡紅色單鏈條帶(泳道1～7)，

表1　TDA-PCR和LATE-PCR所用的引物和焦磷酸測序引物Tab.1　Primers for TDA-PCR，LATE-PCR and pyrosequencing

注：1) 在引物S4-LNA中，大寫字母表示的堿基為LNA，小寫字母表示正常堿基；2) 部分引物中下劃線標(biāo)示的堿基為引入的突變堿基(引突變堿基目的主要是調(diào)整引物Tm值，使PL的Tm值盡可能高些，使TmL與TmX以及TmX與TmA的差值盡可能大些，從而能夠更符合高效進(jìn)行不對稱擴(kuò)增的條件，增大這些擴(kuò)增方法的適用范圍)；3) 產(chǎn)物名稱中F開頭的表示本文所建立的TDA-PCR方法擴(kuò)增，L開頭的表示LATE-PCR方法擴(kuò)增；4) 測序引物部分，產(chǎn)物名稱一欄表示用此擴(kuò)增片段制備的單鏈DNA為測序模板，對應(yīng)的引物為測序引物.

泳道1～7為采用新建立的TDA-PCR方法擴(kuò)增目的 片段的結(jié)果，泳道8～11為采用LATE-PCR 方法擴(kuò)增目的片段的結(jié)果.M為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).圖1　包含SNP1～4的不同長度產(chǎn)物的LATE-PCR 和TDA-PCR擴(kuò)增片段的瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1Agarose gel electrophoretogram results of the amplicons containing SNP1-4 respectively using TDA-PCR and LATE-PCR methods

而LATE-PCR產(chǎn)物同樣可以看到紅色和綠色條帶(泳道8～11)，但TDA-PCR與相對應(yīng)的LATE-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物相比紅色條帶更亮.為了驗(yàn)證TDA-PCR的單鏈擴(kuò)增效率是否高于LATE-PCR，用ImageJ軟件對圖1中目的條帶強(qiáng)度進(jìn)行了分析，結(jié)果見表2，除Fs2和Ls2較接近外，其他均是TDA-PCR的條帶強(qiáng)度高于LATE-PCR，這也證明了本研究建立的TDA-PCR

表2　采用ImageJ軟件對圖1目的 電泳條帶進(jìn)行強(qiáng)度分析結(jié)果Tab.2　The results of intensity analysis of the target electrophoresis bands in Fig.1 by ImageJ tool

體系擴(kuò)增效率較高，特異性較好.

通過對TDA-PCR條件進(jìn)行優(yōu)化，包括DNA聚合酶的選擇(非熱啟動DNA聚合酶)，退火溫度(指數(shù)擴(kuò)增比TmL低1～2 ℃，線性擴(kuò)增比TmX低1～2 ℃)、變性溫度(比TmA高5～10 ℃)、循環(huán)數(shù)(指數(shù)擴(kuò)增階段30個循環(huán)，線性擴(kuò)增階段30個循環(huán))、延伸時間的估算(根據(jù)1 000 bp/min)以及添加PCR增強(qiáng)劑(13%(體積分?jǐn)?shù))甘油，0.48%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))BSA)，建立了一種可以使用非熱啟動DNA聚合酶進(jìn)行TDA-PCR擴(kuò)增的體系.

2.2TDA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測序檢測

2.2.1包含BRCA1基因SNP目的序列的焦磷酸測序

(a)用PSQ96焦磷酸測序系統(tǒng)對Fs3片段部分序列的測序結(jié)果，dNTP加入的順序是：GATCGATCGATCGATC；(b)用自制 焦磷酸測序儀對Fs3片段部分序列的測序結(jié)果，dNTP加入的順序是：GTCATGCAATACGAA；(c)和(d)包含SNP2的DNA 片段的焦磷酸測序結(jié)果，dNTP加入的順序是：TGAGCTCGAGATCATG(對Ls2)和GGAACGTCCTTCTT(對Fs2)；(e)和(f)包含 SNP3的DNA片段的焦磷酸測序結(jié)果，dNTP加入的順序是：AGTCTGATTCGAGAAG(對Ls3)和GTACTCGATAGG(對Fs3).圖2　包含SNP2和SNP3 擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測序結(jié)果Fig.2Comparative results of pyroseuquencing analysis of the amplicons containing SNP2 and SNP3

首先檢測了采用TDA-PCR制備的模板在不同儀器上的適用性，對包含SNP3的目的片段進(jìn)行不對稱擴(kuò)增，然后按照文獻(xiàn)[22]步驟制備焦磷酸測序模板，準(zhǔn)備焦磷酸測序用試劑，在商品化的PSQ96焦磷酸測序儀和自制磷酸測序儀上同時進(jìn)行測序，結(jié)果如圖2所示.從圖中結(jié)果可以看出，PSQ96焦磷酸測序系統(tǒng)(圖2(a))與自制焦磷酸測序儀(圖2(b))結(jié)果一致，采用自制焦磷酸測序儀所獲得的結(jié)果信號要好于PSQ96系統(tǒng)，說明采用TDA-PCR方法制備的單鏈可以在不同焦磷酸測序平臺上使用，具有很好的通用性.然后又分別采用LATE-PCR法和本研究所建立的TDA-PCR法對包含SNP2和SNP3的序列分別進(jìn)行不對稱擴(kuò)增，并用自制焦磷酸測序儀進(jìn)行檢測，均能獲得較為理想的結(jié)果(圖2(c)～(f)).所獲得的SNP基因型結(jié)果一致，SNP2附近序列的LATE-PCR產(chǎn)物L(fēng)s2測得結(jié)果為A￣A￣T￣C￣C￣C￣A￣G￣G￣A￣C￣A￣G￣，A￣A￣后無C￣插入(no ins C)；T￣DA￣-PC￣R產(chǎn)物Fs2測得結(jié)果為G￣G￣G￣A￣T￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣，A￣后無G￣的插入(no ins G).SNP3附近序列的LA￣T￣E-PC￣R產(chǎn)物L(fēng)s3測得結(jié)果為T￣C￣T￣A￣T￣T￣C￣A￣G￣A￣A￣G￣，基因型為C￣C￣；T￣DA￣-P￣C￣R產(chǎn)物Fs3測得結(jié)果為G￣G￣G￣A￣T￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣，基因型為G￣G￣.

為了檢測不同長度擴(kuò)增片段對焦磷酸測序效果的影響，本研究擴(kuò)增了包含SNP1的不同長度片段產(chǎn)物(見圖1)，然后分別對這些產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序檢測，圖3結(jié)果顯示TDA-PCR和LATE-PCR法擴(kuò)增獲得單鏈產(chǎn)物，對SNP1測得的基因型一致，其中不同樣品檢測到了SNP1的GG純合型(樣品g-1，圖3(a)、(c)、(d)和(f))和A/G雜合型(樣品g-2，圖3(b)和(e))的樣本.結(jié)果顯示在對短片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測序時，2種方法均能獲得較為理想的結(jié)果；但是對于長片段的產(chǎn)物，TDA-PCR法獲得的產(chǎn)物測序信號沒有明顯衰減，而LATE-PCR法獲得的產(chǎn)物則出現(xiàn)明顯衰減，這也證明了TDA-PCR法擴(kuò)增對于焦磷酸測序檢測較長DNA片段時具有優(yōu)勢.

2.2.2LNA修飾引物擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測序

dNTP加入的順序：TCAGAGTCAT(對Fs1和Fsb1)和TCGTTGCAA(對Ls1和Lsb1).圖3　采用LATE-PCR和TDA-PCR制備包含SNP1的不同長度擴(kuò)增產(chǎn)物的焦磷酸測序結(jié)果Fig.3The pyrograms of the different length products containing SNP1 amplified by LATE-PCR and TDA-PCR

為了能夠更好地通過焦磷酸測序?qū)U(kuò)增獲得單鏈模板質(zhì)量進(jìn)行檢測，分別采用LATE-PCR和TDA-PCR法擴(kuò)增包含SNP4的不同長度目的片段，然后采用同一測序引物進(jìn)行焦磷酸測序檢測，圖4是將LATE-PCR、TDA-PCR、LNA修飾引物的TDA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行焦磷酸測序的結(jié)果.

dNTP加入順序：GCAGCAGCGTAGATG.圖4　采用不同不對稱擴(kuò)增方法制備包含SNP4位點(diǎn)的單鏈DNA產(chǎn)物的焦磷酸測序結(jié)果Fig.4The pyrograms of the ssDNA products containing SNP4 amplified by different asymmetric amplification methods

由圖4結(jié)果可知，樣品g-1測得序列為AGC(A/G)TGGTAGGAG，SNP4可明顯判讀為雜合型，而且3種方法處理樣品獲得的結(jié)果一致.在擴(kuò)增產(chǎn)物長度為99 bp時，TDA-PCR和LATE-PCR產(chǎn)物信號強(qiáng)度相差不大(圖4(a)和(b))；但是在156 bp時，TDA-PCR信號要遠(yuǎn)好于LATE-PCR(圖4(d)和(e))；經(jīng)過LNA修飾后，95或152 bp產(chǎn)物的信號均較高，且擴(kuò)增片段長度增加時信號并沒有明顯下降(圖4(c)和(f)).結(jié)果表明含有2個LNA的24 bp引物能獲得和28 bp長序列引物相當(dāng)?shù)男Ч?，在焦磷酸測序樣品檢測中甚至優(yōu)于長引物的擴(kuò)增產(chǎn)物.由于LNA修飾引物會引起成本的增加，因此只有在TDA-PCR無法擴(kuò)增出較好結(jié)果時才考慮使用.

2.3禽流感HA基因保守序列的檢測

禽流感病毒H5N1致病性很強(qiáng)，能在極短的時間內(nèi)使大量禽畜死亡，并有可能致人類死亡.其大規(guī)模的流行，不僅造成了相關(guān)產(chǎn)業(yè)的巨大損失，而且由于可傳染人而造成人們極大心理恐慌，因此發(fā)展一種準(zhǔn)確快速診斷方式對這種病毒的防治具有很大意義.本研究選擇禽流感H5N1的HA基因中一段保守序列[31]，采用TDA-PCR法擴(kuò)增制備單鏈并進(jìn)行焦磷酸測序，以期望建立一種較為快速和準(zhǔn)確高效的H5N1病毒檢測方法.

(a)采用TDA-PCR擴(kuò)增H5N1的HA基因部分DNA片段序列(FHA1)的電泳結(jié)果；(b)TDA-RCR擴(kuò)增產(chǎn)物制備單鏈 DNA模板后采用自制的焦磷酸測序儀進(jìn)行測序分析結(jié)果；(c)采用經(jīng)典的磁珠單鏈制備法和商品化PSQ96焦磷酸 測序儀對HA基因特征序列的焦磷酸分析結(jié)果.焦磷酸分析時2種方法dNTP加入順序均為：ATCCTACGTCTTAGCTC.圖5　禽流感病毒H5N1的HA基因TDA-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳及焦磷酸測序結(jié)果Fig.5Agarose gel electrophoretogram and pyrogram results of the HA gene conserved sequence of the H5N1 avian influenza virus amplified by TDA-PCR and sequenced by pyrosequencing

首先根據(jù)H5N1的HA基因序列設(shè)計(jì)引物(見表1)并進(jìn)行LATE-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖5(a).采用TDA-PCR擴(kuò)增出的HA基因目的片段(FHA1，197 bp)僅有一條目的帶，可以用來進(jìn)行焦磷酸測序反應(yīng).為了驗(yàn)證TDA-PCR法制備單鏈的質(zhì)量和通用性，同時采用自制焦磷酸測序儀和商品化的PSQ96焦磷酸測序系統(tǒng)對目的片段進(jìn)行了測序.從結(jié)果(圖5(b)和(c))看，2種焦磷酸測序系統(tǒng)所獲得的結(jié)果一致，根據(jù)測得序列可判定所擴(kuò)增的目的片段為禽流感的HA基因.本研究采用TDA-PCR法制備的單鏈DNA模板獲得的焦磷酸測序結(jié)果，與用當(dāng)前通行的磁珠捕獲法得到的效果相近，但制備流程大大簡化，成本也大為降低，除檢測禽流感病毒特異性基因外，還可應(yīng)用于單細(xì)胞等實(shí)際樣本的檢測[32].

3結(jié)論

自從LATE-PCR擴(kuò)增用于焦磷酸測序制備以后，即被認(rèn)為是一種很有效的寡核苷酸單鏈制備方法，與當(dāng)前通行的磁珠法相比，操作流簡單，效率高；但是由于引物設(shè)計(jì)要求較高，使得其在某些富含AT堿基的片段和長片段擴(kuò)增中的應(yīng)用受到限制.本研究在LATE-PCR基礎(chǔ)上，通過改進(jìn)引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化PCR方法，建立了新的TDA-PCR方法，能夠有效地提高不對稱擴(kuò)增效率，特別是對于較長的目的片段.焦磷酸測序結(jié)果表明TDA-PCR擴(kuò)增的片段能獲得較高的測序信號，可清晰判讀目標(biāo)序列；而相同條件下，LATE-PCR產(chǎn)物的焦磷酸測序信號則出現(xiàn)了明顯下降甚至出現(xiàn)判讀困難.通過進(jìn)一步檢測驗(yàn)證，TDA-PCR方法所制備的單鏈可用于不同焦磷酸測序系統(tǒng)，也可用于實(shí)際樣品的檢測，證明這種方法具有良好的通用性和實(shí)用性.

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doi：10.6043/j.issn.0438-0479.201506017

收稿日期：2015-06-17錄用日期：2016-01-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31200979，81271691，82170734，30973591)；國家國際科技合作項(xiàng)目(2011DFG33320)；福建省自然科學(xué)基金(2016Y0063)；江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃(自然科學(xué)基金)項(xiàng)目(BK20151445)；中國博士后科學(xué)基金(2012M512179，2013T6092)；中國博士后科學(xué)基金特別資助(2013T60962)；藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(MKLDP2013MS01)；江蘇省青藍(lán)工程項(xiàng)目；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(ZQN-PY319，2015ZD008)；華僑大學(xué)高層次人才啟動項(xiàng)目(09BS624)

*通信作者：ghzhou@nju.edu.cn(周國華)；shyhy@hqu.edu.cn(楊會勇)

中圖分類號:Q 755

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0438-0479(2016)04-0485-10

Establishment of the Tm Difference Asymmetric PCR Method and Its Application in Molecular Diagnosis

RAO Huachun1，TENG Jiyun1,DIAO Yong1，SONG Qinxin2,3，WANG Liqiang1，YANG Huiyong1*，ZHOU Guohua2*

(1.Engineering Research Center of Molecular Medicine, Ministry of Education,Institute of Molecular Medicine，School of Biomedical Sciences，Huaqiao University，Quanzhou 362021，China;2.Department of Pharmacology，Jinling Hospital，Nanjing University，School of Medicine，Nanjing 210002，China;3.Key laboratory of Drug Quality Control and Pharmacorigilance,Department of Pharmaceutical Analysis，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China)

Abstract:Detection of single-stranded DNA (ssDNA) is the basis of many molecular diagnostic methods，and how to obtain enough and high quality ssDNA has been one of the hot research topics.In this paper, several sections of DNA (containing one of the three SNPs of BRCA1 gene respectively) were as the research subjects，we carefully optimized the sequences of primers (introducing mismatch bases at the 5′-end of the primers or introducing locked nucleic acid (LNA) into excess primers) and adjusted the concentration of the primers (10 times difference between the excess primer and the limiting primer) to generate the difference of Tm between the excess primer and the limiting primer (3-8 ℃)，and the amplification program was also improved (some PCR enhancers were added into the reaction mixture and a two-stage amplification procedure with two annealing temperatures)，then the Tm difference asymmetric PCR (TDA-PCR) method was used and a large number of target ssDNA molecules were produced.The results showed that TDA-PCR could steadily increase the productivity of the ssDNA molecules，and it became easier than linear-after-the-exponential-PCR (LATE-PCR) for the easier primer designing and the more target DNA producing.This assay amplified the conserved sequence of the influenza HA gene using TDA-PCR，and pyrosequencing method was used to detect the conserved sequence.The pyrograms obtained were of high quality and consistent with the reference sequence，indicating that TDA-PCR not only prepares ssDNA templates for pyrosequencing more easily and more efficiently，but also has good practicality and versatility.

Key words:Tm difference asymmetric PCR (TDA-PCR);single-stranded DNA template;single nucleotide polymorphism;pyrosequencing;Avian influenza virus

引文格式：饒華春，滕繼云，刁勇，等.Tm值差異型不對稱PCR方法的建立及其在分子診斷中的應(yīng)用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2016,55(4)：485-494.

Citation：RAO H C，TENG J Y，DIAO Y,et al．Establishment of the Tm difference asymmetric PCR method and its application in molecular diagnosis[J].Journal of Xiamen University(Natural Science)，2016,55(4)：485-494．(in Chinese)