杜麗娟，汪慶平，邵金良，王　麗，劉興勇，和麗忠

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，昆明　650223)

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響應(yīng)面法對黑果枸杞中花青素測定條件的優(yōu)化

杜麗娟，汪慶平，邵金良，王麗，劉興勇，和麗忠

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，昆明650223)

摘要：以黑果枸杞為原料，采用pH示差法，通過響應(yīng)面法優(yōu)化花青素含量的測定條件。通過單因素試驗(yàn)和Box-Behnken Design試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間、pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間等3個(gè)變量對黑果枸杞中花青素響應(yīng)值的影響程度。根據(jù)響應(yīng)面的最優(yōu)化分析，得出最佳條件是：用80%酸性乙醇溶液，超聲萃取30min，取花青素提取液在pH 1.0和pH 4.5的緩沖液中各平衡80min，在最適波長處測定。通過試驗(yàn)驗(yàn)證，采用pH示差法，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑果枸杞中花青素含量的測定條件，可靠準(zhǔn)確、具有實(shí)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：黑果枸杞；花青素；響應(yīng)面；pH示差法

花青素屬于類黃酮化合物，主要存在于花卉、果實(shí)及有色葉片中，是主要的呈色物質(zhì)?；ㄇ嗨胤N類繁多，迄今為止在自然界中發(fā)現(xiàn)的花青素已經(jīng)超過650種，已知的有20多種，在植物中最常見的有天竺葵色素(Pg)、矢車菊色素(Cy)、飛燕草色素(Dp)、芍藥色素(Pn)、牽?；ㄉ?Pt)和錦葵色素(Mv)。游離的花青素在自然狀態(tài)下不穩(wěn)定，常與糖鍵合成花色苷，以糖苷的形式存在于表皮細(xì)胞的液包內(nèi)?；ㄇ嗨爻噬磻?yīng)差異決定于R1、R2取代基的不同，從而使植物的花、果實(shí)等呈現(xiàn)出多種色彩(藍(lán)色、紅色、紫色等)?；ㄇ嗨貙儆谔烊簧?，安全、資源豐富，易提取，有著巨大的應(yīng)用潛力，具有抗氧化、抗突變、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生等多種生理功能，成為目前天然產(chǎn)物、有機(jī)化學(xué)和生物化學(xué)研究的熱點(diǎn)和焦點(diǎn)之一[1-5]。

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)為茄科枸杞屬的多年生耐鹽、抗旱植物，果實(shí)成熟后為紫黑色，資源量豐富。其成熟果實(shí)含一定量的人體必需脂肪酸、生物堿、酚類、蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸、微量元素、還原多糖及豐富的花青素[2，6-7]。本文針對黑果枸杞，對用pH示差法測定黑果枸杞中花青素含量的條件進(jìn)行了優(yōu)化和討論，從而建立了適合黑果枸杞中花青素含量測定準(zhǔn)確可行的方法，為其花青素的開發(fā)利用提供條件。

1材料、試劑及儀器

材料：黑果枸杞。

試劑：鹽酸，氯化鉀，乙酸，乙酸鈉，乙醇等試驗(yàn)用試劑均為分析純。

儀器：分析天平，超聲儀，pH計(jì)，離心機(jī)，紫外-可見分光光度計(jì)。

2試驗(yàn)方法

2.1試劑配制

pH=1.0緩沖液：0.02mol/L的KCl溶液(1.49g定容至100mL)與0.2mol/L的HCl溶液(1.7mL定容至100mL)按6：5混合，調(diào)pH=1.0。

pH=4.5緩沖液：19.294g NaAc加16mL冰醋酸，定容至500mL，調(diào)pH=4.5。

80%的酸性乙醇溶液：80mL無水乙醇加20mL水，鹽酸調(diào)pH=1.0。

2.2花青素提取液的制備及測定

2.2.1花青素提取液的制備

稱取10g新鮮樣品，加入80%的酸性乙醇溶液超聲萃取30min，重復(fù)提取3次，合并提取液到100mL，10 000r/min離心5min，取上清液，得到花青素提取液。

2.2.2花青素的測定

取10mL花青素提取液，分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖溶液定容至100mL，平衡80min，在最適波長處測定其吸光值。

2.2.3花青素的計(jì)算公式

花青素的計(jì)算公式如(1)式。

(1)

(1)式中，X：花青素的含量(mg/g)；A：吸光值，= pH 1.0～4.5(最大波長的吸光值)；M：矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量，449.2；ε：矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，26900；F：稀釋倍數(shù)；V：樣液終體積(mL)；m：稱樣量(g)。

2.3單因素試驗(yàn)

2.3.1最適提取劑的確定選取不同的有機(jī)溶劑(如無水乙醇、甲醇、丙酮等)，加入適量的有機(jī)酸或無機(jī)酸(如鹽酸、乙酸、檸檬酸等)，使提取劑呈酸性，再對樣品進(jìn)行制備和測定，以確定最適提取劑。

2.3.2最適測定波長的確定將樣品提取液分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋5倍，用分光光度計(jì)在400～600nm進(jìn)行光譜掃描，確定最大吸收光差值所在波長。

2.3.3緩沖液最適平衡時(shí)間的確定取花青素提取液，分別加入同體積的pH1.0和pH4.5緩沖液，搖勻，每20min測定1次吸光值，確定最適平衡時(shí)間。

2.4響應(yīng)面試驗(yàn)

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、pH1.0和pH4.5緩沖液的平衡時(shí)間，應(yīng)用SAS軟件中的中心組合試驗(yàn)(Box-Benhnken)，利用響應(yīng)優(yōu)化面法對黑果枸杞中花青素含量的測定條件進(jìn)行優(yōu)化(表1)。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平

3結(jié)果與分析

3.1單因素試驗(yàn)

3.1.1最適提取劑的確定試驗(yàn)以黑果枸杞鮮果作為提取原料。對所選的提取溶劑來說，既要對有效成分有較大的溶解度，又要避免其溶解大量的其他雜質(zhì)，還要考慮所選溶劑的成本、環(huán)境污染、回收、安全性及工藝過程等很多的因素[1，8]。

花青素含多個(gè)羥基，具有很強(qiáng)的極性，所以提取劑一般選用甲醇、乙醇、丙酮。由于乙醇對提取材料中的蛋白質(zhì)、多糖等的溶解度較低，既可減輕雜質(zhì)處理負(fù)擔(dān)，也可提高色素質(zhì)量，且考慮到甲醇和丙酮的毒性較乙醇強(qiáng)，故使用乙醇做提取劑。此外，花青素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都含有一個(gè)基本的C6 (A環(huán))-C3 (C環(huán))-C6 (B環(huán))的碳骨架，所具有的8個(gè)共軛雙鍵所形成的生色團(tuán)帶有正電荷，在酸性條件(pH≤3.0)下穩(wěn)定，保護(hù)非羥基化的花青素不被降解，故本研究中使用酸性乙醇做提取劑(鹽酸調(diào)pH≤3.0)，提取黑果枸杞中的花青素。若要獲得更接近于天然狀態(tài)的花青素，可采用中性溶劑或弱有機(jī)酸做初步提取，如檸檬酸、酒石酸等[2，3，9-14]。

3.1.2最適測定波長的確定將樣品的花青素提取液分別用pH 1.0和pH 4.5緩沖液稀釋5倍，用分光光度計(jì)在400～600nm進(jìn)行光譜掃描，掃描圖譜見圖1。

圖1　兩種不同緩沖液的掃描

pH值對花青素的穩(wěn)定性影響較大，花青素在溶液介質(zhì)中是以4種可互變的形式平衡存在的，當(dāng)其所處溶液介質(zhì)的pH值發(fā)生變化時(shí)，會引起這種平衡的改變，而偏向某一種形式，從而導(dǎo)致所表現(xiàn)出的色澤和顏色強(qiáng)度發(fā)生變化。花青素在強(qiáng)酸性溶液中呈穩(wěn)定的紅色、弱酸性至中性溶液中呈紅紫色、堿性溶液中呈藍(lán)色，需通過試驗(yàn)確定兩個(gè)對花青素吸光度差別最大，且對其穩(wěn)定的pH，一般選擇pH 1.0和pH4.5。在pH 1.0和pH 4.5緩沖液環(huán)境下的吸光度最大差值出現(xiàn)在525nm處(圖2)，當(dāng)pH=1.0時(shí)該處有最大吸收峰，而當(dāng)pH=4.5時(shí)花色素轉(zhuǎn)化為無色查爾酮形式，在該處無吸收峰，且最大差值能夠最真實(shí)地反映出樣品中的花青素含量。因此，應(yīng)選用525nm作為最適測定波長[3，9，10]。

3.1.3緩沖液最適平衡時(shí)間的確定取花青素提取液，分別加入同體積的pH 1.0和pH 4.5緩沖液，搖勻，每20min測定一次吸光值，計(jì)算不同平衡時(shí)間下花青素的含量(mg/g)。

花青素在緩沖液中的結(jié)構(gòu)為多種結(jié)構(gòu)的動態(tài)平衡，當(dāng)pH發(fā)生改變時(shí)，動態(tài)平衡也隨之變化，而緩沖液平衡體系需要一定時(shí)間后才能穩(wěn)定，故需要在使用緩沖液稀釋之后，穩(wěn)定一段時(shí)間，才能測定吸光值[10]。從圖2可以看出，隨著在緩沖液中的平衡時(shí)間的延長，花青素含量呈上升趨勢，在平衡80min后上升趨勢變緩趨于穩(wěn)定，所以選擇平衡時(shí)間為80min。

圖2　在緩沖液中不同平衡時(shí)間下的花青素含量

3.2響應(yīng)面試驗(yàn)

以黑果枸杞花青素含量為響應(yīng)值Y進(jìn)行響應(yīng)優(yōu)化試驗(yàn)，15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)中分析因點(diǎn)自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)(表2)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)3次，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差[15，16]。利用SAS對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸分析結(jié)果見表3。響應(yīng)因子經(jīng)回歸擬合，解得回歸方程為：Y= 4.823 333 + 0.233 75*X1+ 0.436 25*X2+ 0.247 5*X3-0.447 917*X1*X1-0.2125*X1*X2-0.155*X1*X3-0.6479 17*X2*X2-0.205*X2*X3-0.770 417*X3*X3。決定系數(shù)為R2=0.9425，說明模型的擬合度很好，響應(yīng)值的94.25%的是由于所選變量引起；模型P為0.012 778(P<0.05)，表明該二次方程模型顯著，可以用回歸模型對響應(yīng)值Y(黑果枸杞花青素的含量)進(jìn)行預(yù)測；失擬項(xiàng)為0.112 4(P>0.05)，不顯著，表明所選模型試驗(yàn)結(jié)果適合；一次項(xiàng)的X2和二次項(xiàng)的X1*X1、X2*X2、X3*X3顯著，說明其對花青素含量的測定影響大，且對花青素含量(Y)影響大小順序?yàn)椋篨2>X3>X1，即pH 1.0平衡時(shí)間>pH 4.5平衡時(shí)間>乙醇濃度。

表2　響應(yīng)面分析試驗(yàn)與結(jié)果

表3　二次響應(yīng)面回歸模型方差分析

圖3　Y=f(X1，X2)的響應(yīng)面和等高線

圖4　Y=f(X1，X3)的響應(yīng)面和等高線

圖5　Y=f(X2，X3)的響應(yīng)面和等高線

從圖3可以看出，X1的曲面變化幅度低于X2的曲面變化幅度，說明pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間對花青素含量的測定影響較大。隨著X1和 X2由低到高變化，花青素的含量由低到高，并趨于平緩。從圖4可以看出，X1的曲面變化幅度低于X3的曲面變化幅度，說明pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間對花青素含量的測定影響較大。隨著X1由低到高變化，花青素的含量由低到高，并趨于平緩；而X3較高或較低時(shí)，花青素的含量都較低。從圖5可以看出，X3的曲面變化幅度低于X2的曲面變化幅度，說明pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間對花青素含量的測定影響較大。隨著X2由低到高變化，花青素的含量由低到高，并趨于平緩；而X3較高或較低時(shí)，花青素的含量都較低。

綜上，從因素交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖(圖3～5)可以看出，3個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸行曲線，說明響應(yīng)值Y存在極大值，即黑果枸杞中花青素含量測定的最優(yōu)條件存在于所設(shè)計(jì)的因素水平范圍之內(nèi)[15，16]。因此據(jù)SAS軟件中Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，可以得出黑果枸杞中花青素含量測定的最優(yōu)化條件：乙醇濃度80%，pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間80min，pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間80min。采用響應(yīng)面法對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及優(yōu)化參數(shù)能很好地預(yù)測花青素含量測定的最優(yōu)條件，具有一定的可靠性和參考價(jià)值。

根據(jù)上述最優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，即乙醇濃度80%，pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間80min，pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間80min，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，黑果枸杞中花青素含量為4.73mg/kg(n=3，RSD=0.96%)。與理論預(yù)測值相比，其相對誤差約為0.09mg/kg，且重復(fù)性也很好，說明優(yōu)化結(jié)果可靠。

4結(jié)論

用SAS 軟件對黑果枸杞中花青素含量的測定建立了多元回歸模型， 考察了乙醇濃度、 pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間、pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間，3個(gè)因素對黑果枸杞中花青素含量測定的影響程度。在本試驗(yàn)中，這3個(gè)因素對花青素的影響大小依次是：pH 1.0平衡時(shí)間>pH 4.5平衡時(shí)間>乙醇濃度。

根據(jù)SAS軟件中 Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析， 試驗(yàn)確定了提取花青素的最佳測定條件：乙醇濃度80%，pH 1.0緩沖液平衡時(shí)間80min，pH 4.5緩沖液平衡時(shí)間80min。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑果枸杞中花青素含量的測定條件，可靠準(zhǔn)確，具有實(shí)用價(jià)值?！?/p>

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(責(zé)任編輯李燕妮)

基金項(xiàng)目：云南省科技惠民專項(xiàng)(農(nóng)業(yè))重點(diǎn)項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2014RA054)；云南省科技創(chuàng)新平臺建設(shè)計(jì)劃(公共科技服務(wù))項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：2014DA001)。

作者簡介：杜麗娟(1981—)，女，碩士，助理研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)分析和質(zhì)量安全評價(jià)等。

通訊作者：和麗忠(1963—)，男，碩士，研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)分析和質(zhì)量安全評價(jià)等。

Optimization on Testing Conditions of Anthocyanins in Lycium ruthenicum by Response Surface Methodology

DU Li-juan，WANG Qing-ping，SHAO Jin-liang，WANG Li，LIU Xing-yong，HE Li-zhong

(Institute of Agriculture Quality Standards & Testing Technique，Yunnan Academy of Agricultural Science，Kunming 650223，China)

Abstract：This paper applied response surface methodology to optimize the technological parameters of anthocyanidin in Lyceum ruthenicum and studied the influences of ethanol’s volume fraction，pH 1.0 buffer’s balancing time and pH 4.5 buffer’s balancing time on the response value of anthocyanidin in Lyceum ruthenicum through single factor tests and Box-Behnken Design.The results showed that the optimum parameters were acid alcohol of 80%，pH 1.0 buffer’s balancing time and pH 4.5 buffer’s balancing time were 80 min.Under the optimum conditions， pH-differential method was used to determine anthocyanidin.The research technique was reliable and convenient.

Keywords：Lycium ruthenicum;anthocyanin;response surface methodology;pH-differential method