張倩勉（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧530021）

HPLC-MS法測(cè)定米酒中的甜蜜素含量

張倩勉
（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧530021）

摘要：通過HPLC-MS方法，同時(shí)采用正負(fù)離子模式進(jìn)行多反應(yīng)檢測(cè)（MRM），對(duì)米酒中的甜蜜素進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，檢出限（3S/N）為0.1 μg，回收率在85.4%～97.8%之間，RD值為2.9%～4.5%。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，適宜于米酒中甜蜜素的快速測(cè)定。

關(guān)鍵詞：HPLC-MS；米酒； 甜蜜素；含量

甜蜜素（sodium cyclamate），化學(xué)名為環(huán)己基氨基磺酸鈉，是食品生產(chǎn)中常用的合成甜味劑之一，廣泛應(yīng)用于各類食品。酒是糧食或水果經(jīng)發(fā)酵而成的飲料產(chǎn)品，富含人體需要的營(yíng)養(yǎng)成分，適量飲用可預(yù)防多種疾病。隨著我國(guó)人民生活水平的提高，酒的消費(fèi)量呈現(xiàn)了快速增長(zhǎng)的趨勢(shì)，同時(shí)人們對(duì)酒中添加的人工合成甜味劑安全性的關(guān)注也越來越高［1-3］。GB 2760—2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》明確規(guī)定，除了在配制酒中可以使用甜蜜素，而且最大使用量為0.65 g/kg外，在蒸餾酒和發(fā)酵酒中均不得使用甜蜜素。但是甜蜜素濫用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，如果長(zhǎng)期食用甜蜜素超標(biāo)的食品，就會(huì)因攝入過量而對(duì)人體造成危害。因此監(jiān)測(cè)和評(píng)估甜蜜素的風(fēng)險(xiǎn)非常重要。目前測(cè)定酒中甜蜜素的方法，主要有液相色譜法［4-6］、氣相色譜法［7-10］、LC-MS法［11-19［20］、離子色譜法［21-23］、分光光度法［24］。由于酒中成分復(fù)雜，存在的干擾物質(zhì)較多，使得檢測(cè)結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性。本試驗(yàn)采用HPLC-MS法測(cè)定米酒中甜蜜素的含量，主要通過正負(fù)離子兩種模式進(jìn)行多反應(yīng)檢測(cè)，物質(zhì)色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液相應(yīng)化合物的保留時(shí)間一致，且樣品譜圖中組分定性定量離子的相對(duì)豐度比與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作液譜圖中對(duì)應(yīng)組分的定性定量離子的相對(duì)豐度比一致，允許偏差參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)（2002/657/EC）。使用該方法測(cè)定米酒中甜蜜素的含量更為準(zhǔn)確、靈敏、高效。

1　材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

米酒，抽檢；甜蜜素對(duì)照品，純度≥98.0%，xStandard公司；乙酸、甲醇均為色譜純；水為超純水。

儀器設(shè)備：Agilent-1260高效液相色譜-Triple Quad 5500質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；S205DU分析天平。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)照品儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取甜蜜素111.56 mg，置于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，搖勻，即得甜蜜素對(duì)照品儲(chǔ)備液，濃度為10.93 mg/mL。

1.2.2對(duì)照品工作液

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻（濃度為109.3 μg/mL），精密量取該溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得對(duì)照品工作液（濃度為1.093 μg/mL）。

1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

取5個(gè)10 mL容量瓶，分別加入對(duì)照品工作液0.1 mL、0.3 mL、0.6 mL、1.2 mL、2.0 mL，加水定容至刻度，搖勻，即得曲線L1、L2、L3、L4、L5，甜蜜素濃度分別為10.93 ng/mL、32.80 ng/mL、65.58 ng/mL、131.2 ng/mL、218.7 ng/mL。

1.2.4色譜條件

色譜柱：XBridge-C184.6 mm×75 mm，2.5 μm；流動(dòng)相組成為0.1%乙酸水溶液-甲醇，流速：0.4 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1　流動(dòng)相洗脫程序

1.2.5質(zhì)譜條件

1.2.5.1負(fù)離子模式

離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式：MRM；氣簾氣流速：35 L/min；離子源溫度：650℃；碰撞氣流速：6 L/min；噴霧電壓：-4500V；輔助氣流速：50 L/min；其余質(zhì)譜條件見表2。

1.2.5.2正離子模式

離子源：電噴霧離子源；檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；氣簾氣流速：35 L/min；離子源溫度：650℃；碰撞氣流速：6 L/min；噴霧電壓：5500 V；輔助氣流速：50 L/min；其余質(zhì)譜條件見表2。

表2　甜蜜素檢測(cè)的質(zhì)譜條件

1.2.6樣品處理

1.2.6.1供試品溶液制備

取10 mL容量瓶，精密加入供試品10 mL，用水浴加熱氮吹儀除去乙醇，冷卻后，用水定容至刻度，搖勻，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.2.6.2加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

取6個(gè)10 mL容量瓶，精密加入空白供試品10 mL，用水浴加熱氮吹儀除去乙醇，冷卻后，分為3組，分別加入0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL對(duì)照品工作液，并用水定容至刻度，搖勻，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.2.6.3檢出限溶液制備

取2個(gè)10 mL容量瓶，精密加入空白供試品10 mL，用水浴加熱氮吹儀除去乙醇，冷卻后，加入0.1 mL對(duì)照品工作液，并用水定容至刻度，搖勻，然后用0.22 μm濾膜過濾，濾液待上機(jī)分析。

1.2.6.4樣品測(cè)定方法

將處理好的待測(cè)液放入自動(dòng)進(jìn)樣器的樣品盤上，進(jìn)樣器自動(dòng)進(jìn)樣1 μL，數(shù)據(jù)采集采用Analyst Software工作站進(jìn)行采集處理，采用Quantitative Analysis軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，使用外標(biāo)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得出樣品溶液中甜蜜素的質(zhì)量濃度。再根據(jù)以下公式得出檢測(cè)結(jié)果。

結(jié)果計(jì)算公式：

式中：W為樣品中甜蜜素（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）的含量（μg/L）；C為測(cè)得濃度（ng/mL）；V為稀釋倍數(shù)；M為樣品取樣量（mL）；0.891為環(huán)己基氨基磺酸鈉與環(huán)己基氨基磺酸的換算系數(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜與色譜條件的選擇

將含有1 μg/mL的甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，找到最佳的電離模式。結(jié)果表明在正負(fù)離子模式下，各有一對(duì)離子響應(yīng)較強(qiáng)，分別選擇［M-Na］以及［M+H］作為母離子，進(jìn)行碰撞能量的優(yōu)化。以負(fù)離子模式下的離子對(duì)作為定量離子。質(zhì)譜條件見表2。本實(shí)驗(yàn)用含0.1%乙酸的水溶液和甲醇作為流動(dòng)相，由于酒中成分復(fù)雜，故采用梯度洗脫，使目標(biāo)化合物能更好地與其他干擾物質(zhì)分離。

2.2線性關(guān)系

把標(biāo)準(zhǔn)品曲線注入液相質(zhì)譜聯(lián)用儀，以峰面積為（Y）軸，相對(duì)質(zhì)量濃度為（X）軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程，結(jié)果見圖1。結(jié)果顯示，用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)甜蜜素在10～200 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，R為0.9998，能夠滿足定量分析的需要。結(jié)果偏差參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)（2002/657/EC），檢驗(yàn)結(jié)果用定性定量離子峰面積比進(jìn)行判定。從所測(cè)得待測(cè)物的結(jié)果顯示，定性定量離子峰面積比在標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的定性定量離子峰面積比規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)。所參照的標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3，線性關(guān)系及結(jié)果見圖1、表4。

表3　 歐盟標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.3回收率

回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加不同濃度的甜蜜素，回收率在85.4%～97.8%之間，RD值為2.9%～4.5%。而且回收率結(jié)果的定性定量離子峰面積之比均在歐盟標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的偏差范圍內(nèi)。結(jié)果見表5。

2.4樣品檢測(cè)結(jié)果

按照1.2.6對(duì)樣品進(jìn)行前處理，然后進(jìn)樣分析。用負(fù)離子模式的離子對(duì)為定量離子，并通過定性定量離子峰面積之比，參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)偏差對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線采用外標(biāo)法定量，計(jì)算樣品中甜蜜素（以環(huán)己基氨基磺酸計(jì)）的含量，結(jié)果見表6。

圖1　甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表4　標(biāo)準(zhǔn)曲線、待測(cè)樣品、回收率以及檢出限正負(fù)離子峰面積的關(guān)系

表6　米酒中甜蜜素的測(cè)定結(jié)果

2.5方法檢出限

在本實(shí)驗(yàn)條件下，在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，以質(zhì)譜儀3倍信噪比計(jì)算目標(biāo)物組分的檢出限為0.1 μg，而且其正負(fù)離子峰面積之比在所參考的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)。

表5　線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)加入回收率

3　結(jié)論

本研究建立了米酒中甜蜜素的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法，同時(shí)采用正負(fù)離子模式進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，并參照歐盟標(biāo)準(zhǔn)偏差，大大減少了結(jié)果的假陽性概率，定性的準(zhǔn)確性大幅提高。該方法便于操作，靈敏度、重現(xiàn)性良好，檢出限低，可作為米酒中甜蜜素的確證分析。

參考文獻(xiàn)：

［1］李曉瑜.非營(yíng)養(yǎng)性甜味劑的安全性研究進(jìn)展及管理現(xiàn)狀（綜述）［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2002，14（4）：43-45.

［2］魯琳，杭義萍，高燕紅，等.食品甜味劑分類及其檢測(cè)技術(shù)現(xiàn)狀［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，36（11）：2033-2035.

［3］朱興江，丁振華，方猛，等.人工合成甜味劑與防腐劑的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)［J］.食品工業(yè)科技，2009，30（8）：340-345.

［4］臧光樓，董明盛.白酒中甜蜜素檢測(cè)方法的研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（10）：361-364.

［5］邵鐵鋒，李雪岷，陳勤偉，等.高效液相色譜法測(cè)定酒中甜蜜素［J］.中國(guó)釀造，2004（12）：31-32.

［6］劉渭萍，雷雅娟.高效液相色譜法快速測(cè)定葡萄酒及果酒中的防腐劑和甜昧劑［J］.遼寧化工，2006，35（4）：238-239

［7］陳玉波，蘇建國(guó)，薛銀飛，等.氣相色譜毛細(xì)管柱內(nèi)標(biāo)法測(cè)定白酒中甜蜜素含量［J］.淮陰工學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，18（1）：65-68.

［8］張麗薇，馬瑩，蔣素，等.氣相色譜法測(cè)定葡萄酒中的甜蜜素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19（12）：2807-2808.

［9］李鋒格，竇輝，姚偉琴，等.毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定葡萄酒中甜蜜素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15（6）：707-708.

［10］張燕，趙永福，許紅.葡萄酒中環(huán)己基氨基磺酸鈉（甜蜜素）的氣相色譜法測(cè)定［J］.葡萄釀酒，2003（3）：54-55.

［11］王震，石麗珠.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定飲料和酒中防腐劑與甜味劑［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2014，5（4）：1179-1184.

［12］周彬，呂任一，肖麗恒，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定酒類產(chǎn)品中多種人工合成甜味劑［J］.食品科學(xué)，2014，35（12）：218-222.

［13］徐春祥，秦金平.液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用直接測(cè)定白酒中甜蜜素［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2006，32（2）：106-107.

［14］國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì).出口食品環(huán)己基氨基磺酸鈉的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法：SN/T 1948—2007 ［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［15］吳世嘉，王洪新，陶冠軍.超高壓液相色譜-質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定白酒中6種微量甜味劑的方法研究［J］.食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2010，25（5）：670-675.

［16］肖晶，方從容，楊大進(jìn)，等.高效液相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定酒中甜蜜素含量的研究［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2013，25（3）：254-256.

［17］王駿.HPLC/MS測(cè)定白酒中的微量甜味劑［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33（10）：152-154.

［18］秦昉，王林祥，陶冠軍.液質(zhì)聯(lián)用法同時(shí)測(cè)定黃酒中糖精鈉和甜蜜素［J］.釀酒科技，2005（9）：84-86.

［19］郭瑩瑩，喬善磊，李磊，等.白酒和調(diào)香劑中四種人工合成甜味劑的UPLC-MS-MS測(cè)定［J］.食品科學(xué)，2010，31（14）：245-249.

［20］姜文良，錢玉根，楊民.GC-MS法測(cè)定黃酒中的甜蜜素［J］.中國(guó)食品添加劑，2008（5）：156-158.

［21］李紅艷.白酒中甜蜜素的無衍生離子色譜法檢測(cè)［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（8）：859-863

［22］溫雅，趙丹瑩.白酒中甜蜜素的固相萃取離子色譜測(cè)定法［J］.職業(yè)與健康，2010，26（15）：1712-1713.

［23］郭蒙京，溫雅，趙丹瑩.紅葡萄酒中甜蜜素的固相萃取離子色譜測(cè)定法［J］.職業(yè)與健康，2010，26（2）：161-162.

［24］黃會(huì)秋.分光光度法間接測(cè)定白酒中甜蜜素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（9）：1073-1074.

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-23；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160323.1530.006.html。

中圖分類號(hào)：TS262.4；TS261.4；TS261.7

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）07-0116-03

DOI：10.13746/j.njkj.2016002

收稿日期：2016-01-06

作者簡(jiǎn)介：張倩勉（1981-），女，廣西北海人，碩士研究生，工程師，研究方向：食品安全檢測(cè)。

Determination of Sodium Cyclamate Content in Rice Wine by HPLC-MS

ZHANG Qianmian
（Guangxi&ASEAN Inspection&Testing Center For Food and Drug Safety，Nanning，Guangxi 530021，China）

Abstract:Sodium cyclamate content in rice wine was measured by HPLC-MS coupled with the positive and negative ions modes of MRM. The results showed that a good linearity was obtained for the standard curve of the method，its correlation coefficient was high（r=0.9998），its detection limit was 0.1 μg（3S/N），its recovery rate was between 85.4%-97.8%，and RD value was 2.9%-4.5%.This method was rapid，simple，sensitive and accurate，and it was a suitable method for rapid determination of sodium cyclamate content in rice wine.

Key words:HPLC-MS；rice wine；sodium cyclamate；content