王瀅雪，劉雪平，孫翔宇，侯彩云，戰(zhàn)吉宬（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京市葡萄科學與釀酒技術重點實驗室，北京100083）

RP-HPLC法同時測定果酒中13種酚類化合物

王瀅雪，劉雪平，孫翔宇，侯彩云，戰(zhàn)吉宬
（中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京市葡萄科學與釀酒技術重點實驗室，北京100083）

摘要：建立了一種適用于多種果酒中13種多酚類化合物（5種黃烷-3-醇、4種黃酮醇、2種酚酸、2種芪類）含量測定的HPLC分析方法。色譜條件為：LiChrospher 100 RP-18e柱，流動相A為水（0.1%磷酸），流動相B為甲醇（0.1%磷酸），梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測波長為272 nm。在該色譜條件下各個物質在48 min內得到了良好的分離，各物質的含量與峰面積呈良好的線性關系，相關系數（R2）均大于0.998，且回收率在73%～123%之間，重復性好，具有定量準確、快速等特點。運用該方法測定了6種葡萄酒、7種藍莓酒、5種桑葚酒中13種酚類化合物的含量。結果表明，葡萄酒中含有全部13種多酚化合物，藍莓酒中有10種，桑葚酒中有9種。葡萄酒中黃烷-3-醇的含量較高，藍莓酒和桑葚酒中黃酮醇的含量較高，葡萄酒和桑葚酒均含有白藜蘆醇，藍莓酒不含。該方法準確、可靠，可適用于多種果酒中13種酚類化合物的測定。

關鍵詞：果酒； 酚類化合物； 反相高效液相色譜

果酒是以新鮮水果或果汁為原料，經過破碎、壓榨取汁、發(fā)酵、澄清、陳釀等工藝精心釀制調配而成的低度飲料酒。根據國家優(yōu)質食品評選標準（果酒部分），按原料不同將果酒分為7類：北方漿果類、仁果類、核果類、柑橘類、獼猴桃類、山楂類和棗類［1］。葡萄、藍莓、桑葚等漿果中含有豐富的黃烷-3-醇、黃酮醇、酚酸、芪類等多酚類物質，并且有較高的抗氧化性，其保健功能越來越為人們所知。近年來，隨著人們對保健型果酒的消費需求越來越大，葡萄酒、藍莓酒、桑葚酒等漿果類果酒也越來越多的引起人們的重視［2］。多酚類物質不僅與果酒的色澤、風味等品質指標密切相關，而且賦予了果酒一定的保健功效和抗氧化能力［3-7］。所以，對果酒中重要多酚類物質的分析檢測具有重要意義。

多酚類物質主要結構是苯環(huán)，其結構中有一個或多個羥基組。基于它們碳環(huán)結構的差異，可將多酚劃分為類黃酮和非類黃酮類物質。果酒中，類黃酮主要是黃烷醇、黃酮醇、花青素類等，非類黃酮類物質主要是酚酸和芪類（白藜蘆醇）等［3］。研究發(fā)現(xiàn)［2-20］，葡萄酒、藍莓酒、桑葚酒中含量較高的主要多酚類化合物見表1。

表1　葡萄酒、藍莓酒、桑葚酒中主要酚類化合物

近年來，許多學者用HPLC法對果酒中酚類物質進行了研究［8-11］。但在這些研究中，多為分別測定酚酸、黃烷-3-醇、黃酮醇、芪類，并只適用于某一種果酒，很少見到在同一色譜條件下，較短時間內將果酒中主要的、含量較高的黃烷-3-醇、黃酮醇、芪類等酚類化合物同時分離測定的報道。

本研究采用梯度洗脫程序，建立了果酒中主要的、含量較高的13種多酚類化合物含量測定的HPLC分析方法。13種多酚類化合物包括：5種黃烷-3-醇（兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯）、4種黃酮醇（槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷），2種酚酸（沒食子酸、阿魏酸），2種芪類（白藜蘆醇、虎杖苷）。并且，采用建立的HPLC方法對7個品種的藍莓酒、6個品種的葡萄酒、5個品種的桑葚酒進行了含量檢測，獲得了滿意的結果。

1　材料與方法

1.1材料、儀器與試劑

樣品：6個品種的葡萄酒（赤霞珠、美樂、西拉、馬瑟蘭、蛇龍珠、黑比諾），為2012年產自懷來；7個品種的藍莓酒（藍豐、公爵、達柔、圓藍、芝妮、杰兔、美登），由實驗室釀制；5個品種桑葚酒（紅果、龍桑、沙霓、大十、白玉王），由實驗室釀制。

儀器設備：Waters-2695高效液相色譜儀，美國Waters；PDA紫外檢測器Waters-2996，美國WatersAUY220；色譜柱LiChrospher 100 RP-18e，德國Merck；KQ-300TDE型高頻數控超聲波清洗機；AUY220分析天平，日本SHIMADZU；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵，河南予華。

試劑：兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、桑色素、木犀草素、槲皮苷、沒食子酸、阿魏酸、白藜蘆醇、虎杖苷標準品均購于成都曼斯特生物科技有限公司；甲醇（色譜級），賽默飛世爾科技公司；磷酸（色譜級），成都西亞化工股份有限公司；乙酸乙酯（分析純），北京化工廠。

1.2實驗方法

1.2.1色譜條件

色譜柱：LiChrospher 100 RP-18e反相C18柱，流動相A為水（0.1%磷酸），流動相B為甲醇（0.1%磷酸）。梯度洗脫：0～10 min，B為10%～37%；10～17.5 min，B為37%；17.5～18.5 min，B為37%～40%；18.5～26 min，B 為40%；26～27 min，B為40%～54%；26～47 min，B為54%；47～48 min，B為10%。流速為0.5 mL/min，檢測波長為272 nm，進樣量10 μL。

1.2.2標準溶液的配制

準確稱取兒茶素、表兒茶素等13種標準品各25.0 mg，分別用90%甲醇水溶液定容至5 mL棕色容量瓶中，得到各標準品的標準儲備液，-30℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，根據實驗需要將標準儲備液用甲醇稀釋至適合濃度配制成標準工作液和混合標準工作液。

1.2.3樣品處理

取果酒25 mL，以2倍料液比用乙酸乙酯萃取3次，取出酯相合并，35℃旋蒸至干。殘渣溶于5 mL 90%甲醇水溶液，過0.45 μm濾膜，作為樣品溶液。

1.2.4方法學考察

線性關系與檢出限：在最佳色譜條件下，選取定量下限濃度以上的不同濃度混合標準工作液進行液相分析，分別獲得各自的峰面積，通過建立樣品濃度與峰面積的標準曲線，計算標準曲線的回歸方程及相關系數，考察線性相關性。將配制的混合標準品儲備液逐步稀釋，并以信噪比（RSN）為3時所對應的標準溶液中所含組分的含量為檢出限（LOD）。

精密度與加標回收率：向已知單體酚含量的樣品5份，定量精密添加標準品的混合標準工作液，充分混勻后按照1.2.3制備樣品（n=5）。在最佳條件下測定13種物質的回收率。

重復性與穩(wěn)定性：取同一批次的樣品溶液，在最佳條件下連續(xù)測定5次，記錄峰面積與保留時間，并計算各物質的含量，計算RSD值，分析樣品的重復性。取同一批次的樣品溶液，在最佳條件下分別于0、4 h、8 h、16 h、24 h進樣，記錄峰面積與保留時間，并計算各物質的含量，計算RSD值，分析樣品的穩(wěn)定性。

1.2.5樣品測定

以該方法分別測定葡萄酒、藍莓酒、桑葚酒3種果酒中13種物質的含量，分析方法對于樣品的適用性。

2　結果與討論

2.1色譜條件的選擇

2.1.1檢測波長的選擇

用PDA檢測器對兒茶素等13種物質標準樣品溶液進行最大吸收光譜掃描。13種物質的吸收光譜圖顯示，標準樣品的最大吸收峰雖然各不相同，但在272 nm處均有最大或者較大吸收峰。綜合考慮，選取272 nm作為檢測波長為宜。

2.1.2柱溫與流速的選擇

實驗比較了色譜柱溫度在25.0℃、30.0℃、35.0℃和40.0℃4個柱溫條件下13種酚類物質混合標準品以及樣品中色譜峰的分離情況。結果發(fā)現(xiàn)，在所考察的4個溫度條件中，30.0℃的分離度最佳，因此本實驗采用色譜柱溫為30.0℃。同時，實驗比較了流動相流速在0.1～1.0 mL/min內13種酚類物質混合標準品以及樣品中色譜峰的分離情況，結果發(fā)現(xiàn)，流速為0.5 mL/min時，出峰效果最好，確定流速為0.5 mL/min。

2.1.3梯度洗脫條件

實驗對洗脫梯度進行優(yōu)化，確定洗脫程序：0～10 min，B為10%～37%；10～17.5 min，B為37%；17.5～18.5 min，B為37%～40%；18.5～26 min，B為40%；26～27 min，B為40%～54%；26～47 min，B為54%；47～48 min，B 為10%。在此梯度洗脫條件下，13種酚類物質達到很好的色譜分離，標樣色譜圖見圖1，樣品色譜圖見圖2。

圖1　13種酚類物質標準品色譜圖

2.2線性關系與檢測限

13種酚類化合物的濃度范圍、線性方程、相關系數和檢出限結果見表2。從表2可以看出，沒食子酸等13種物質標準品的相關系數（R2）均大于0.998，質量濃度和相應峰面積呈良好線性關系。并且它們的最低檢測限都較低，能滿足定量分析要求，說明此方法靈敏度較高。

圖2　樣品色譜圖

2.3精密度與加標回收率

最佳色譜條件下，13種物質的回收率結果見表3。13種物質的回收率為73%～123%，回收率的RSD在5.0%以下。結果表明，該方法精密度良好，加標回收率符合要求。

2.4重復性與穩(wěn)定性

重復性：最佳色譜條件下，5份樣品測定結果顯示，13種物質峰面積RSD為0.51%、0.58%、0.44%、0.92%、0.63%、1.97%、1.78%、0.50%、1.83%、1.26%、1.11%、0.79%，表明該方法重復性良好。

穩(wěn)定性：最佳色譜條件下，同一樣品5次測定結果顯示，13種物質峰面積RSD為0.79%、1.03%、1.97%、0.25%、1.34%、0.69%、0.69%、1.71%、0.48%、0.62%、0.47%、1.37%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5樣品測定

按照色譜條件對6個品種的葡萄酒、7個品種的藍莓酒、5個品種的桑葚酒進行了含量檢測，結果見表4。

表2　13種酚類化合物的保留時間、回歸方程、線性范圍和檢測限

表3　13種酚類化合物的精密度和加標回收率實驗結果

表4　葡萄酒樣品中13種酚類化合物的含量分析?。╩g/L）

測定結果表明，葡萄酒所含酚類化合物種類較多、平均含量較高，尤其是黃烷-3-醇，葡萄酒中含有5種，而藍莓酒和桑葚酒只含有3種和2種。而就黃酮醇而言，藍莓酒和桑葚酒中的含量略高于葡萄酒，其中藍莓酒最高。葡萄酒中沒食子酸的含量遠遠超過藍莓酒和桑葚酒，且葡萄酒中沒食子酸含量因品種不同差異較大，而藍莓酒和桑葚酒比較穩(wěn)定，都比較低。葡萄酒和桑葚酒中都含有白藜蘆醇，而藍莓酒中不含，但藍莓酒中含有虎杖苷，而桑葚酒中不含。

6種葡萄酒中有4種均可檢測到13種化合物，其中，馬瑟蘭和赤霞珠所含酚類化合物相對較多。沒食子酸、兒茶素、表兒茶素是葡萄酒中的主要酚類化合物。測定結果與文獻報道結果基本一致［9-12］，但本實驗葡萄酒樣品中的表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯的含量要高于王秀芹等［12］所報道，這可能與葡萄酒樣品的品種、產地等不同有關。

與葡萄酒相比，藍莓酒中黃烷醇的種類和含量相對較低，而黃酮醇的含量相對較高，尤其是槲皮素和槲皮苷。翁芳華等［13］檢測到藍莓酒中含有4種黃烷醇，而本實驗中藍莓酒中能被檢測到的黃烷醇只有3種，其中表沒食子兒茶素未曾檢測到。藍莓酒的7個品種中，達柔和藍豐所含酚類化合物較多。7個品種的藍莓酒中均未檢測到白藜蘆醇，只有圓藍檢測到了虎杖苷。

桑葚酒中所含酚類化合物的種類與藍莓酒相似，不同之處在于桑葚酒不含表兒茶素沒食子酸酯，而含有白藜蘆醇。桑葚酒在所含酚類化合物種類上雖不及葡萄酒，但在黃酮醇的總含量上是超過葡萄酒的，這與李岳珍等［14］所報道的桑葚酒中黃酮醇含量情況的比較是一致的。

表5　藍莓酒樣品中13種酚類化合物的含量分析　（mg/L）

表6　桑葚酒樣品中13種酚類化合物的含量分析?。╩g/L）

表7　3種酒中13種酚類化合物的平均含量?。╩g/L）

3　結論

漿果類果酒風味良好，富含多種酚類物質，同時又兼具良好的保健功能，具有良好的發(fā)展前景。但果酒中酚類物質結構復雜、種類繁多，許多酚類物質化學結構和性質相似，使其分離較難。高效液相色譜具有靈敏度高、選擇性強、色譜柱的選擇范圍寬、樣品預處理簡單等特點，是檢測酚類化合物最常用的方法之一。

本實驗采用RP-HPLC法，為樣品分析提供了較為豐富的定性和定量信息，并通過對流動相、洗脫條件、柱溫、流速等色譜條件的優(yōu)化，在最佳色譜條件下13種酚類物質均得到了很好的分離。經方法學驗證，各物質的線性關系良好，檢測限低，加樣回收率準確度較高，相對標準偏差較好，將方法用于葡萄酒、藍莓酒、桑葚酒等果酒樣品的測定，結果表明該方法準確、可靠，適于果酒中酚類物質含量的分析。為同時測定果酒中不同種類的多酚建立了一種可靠的方法。

參考文獻：

［1］劉瑞山，張小妮.果酒的發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢［J］.飲料工業(yè)，2013，16 （11）：43-47.

［2］蔣本慶，高銘坤.果酒的保健功效及藍莓果酒發(fā)展分析研究［J］.釀酒，2015（2）：115-118.

［3］Li H，Wang X Y，Li Y，et al.Polyphenolic compounds and antioxidant properties of selected China wines［J］.Food Chemistry，2009，112（2）：454-460.

［4］Chen X N，F(xiàn)an J F，Yue X，et al.Radical scavenging activity and phenolic compounds in persimmon（Diospyros kaki L.cv. Mopan）［J］.Journal of Food Science，2008，73（1）：24-28.

［5］Qu W J，BreksaAW，Pan Z L，et al.Quantitative determination of major polyphenol constituents in pomegranate products［J］. Food Chemistry，2012，132（3）：1585-1591.

［6］Su M S，Chen P J.Antioxidant activity，anthocyanins，and phenolics rabbiteye blueberry（Vaccinium ashei）fluid products as affected by fermentation［J］.Food Chemistry，2007，104：182-187.

［7］Jang M，Cai L，Udeani G O，et al.Cancer chemopreventive activity of resveratrol，a natural product derived from grapes ［J］.Science，1997，275（5297）：218.

［8］孫翔宇，杜國榮，馬婷婷，等.RP-HPLC法同時測定葡萄酒、果酒、果醋中16種單體酚的含量［J］.現(xiàn)代食品科技，2014（12）：201-209.

［9］Lopeza M，Martineza F，Del Valle，et al.Analysis of phenolic constituents of biological interest in red wines by highperformance liquid chromatography［J］.Journal of ChromatographyA，2001，922：359-363.

［10］Fang F，Li J M，Pan Q H.Determination of red wine flavonoids by HPLC and effect of aging［J］.Food Chemistry，2007，101：428-433.

［11］Li Z C，Chi L Z，Zhu J K，et al.Simultaneous determination of active ingredients in blueberry wine by CE-AD［J］.Chinese Chemical Letters，2011（10）：1237-1240.

［12］王秀芹，張慶華，戰(zhàn)吉宬，等.產地與品種對葡萄酒中酚類物質含量的影響［J］.食品科學，2009（21）：113-118.

［13］翁芳華，溫鵬飛，黃衛(wèi)東.藍莓酒中5種黃烷-3-醇單體高效液相色譜檢測研究［J］.中國釀造，2006（2）：61.

［14］李岳珍，侯鈺，陳欣悅，等.不同前處理發(fā)酵的桑椹紫酒黃酮醇物質的比較［J］.釀酒科技，2012（7）：105-107.

［15］焦揚，宋海，張勇，等.3種野生漿果果酒中活性物質及抗氧化活性比較［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（1）：60-65.

［16］Sun L J，Guo Y R，F(xiàn)u C C，et al.Simultaneous separation and purification of total polyphenols，chlorogenic acid and phlorizin from thinned young apples［J］.Food Chemistry，2013，136（2）：1022-1029.

［17］李辰辰，陸小騰駕，童華榮.HPLC-Q-TOF-MS-MS測定桑椹中多酚類物質［J］.食品科學，2015，36（2）：101-104.

［18］Dietmar K，Achim C，Reinhold C，et al.Polyphenol screening of pomace from red and white grape varieties（Vitis vinifera L.）by HPLC-DAD-MS/MS.［J］.Journal ofAgricultural& Food Chemistry，2004，52（14）：4360-4367.

［19］Wu X L，Prior R L.Systematic identification and characterization of anthocyanins by HPLC-ESI-MS/MS in common foods in the United States:fruits and berries［J］. Journal ofAgricultural&Food Chemistry，2005，53（7）：2589-2599.

［20］黃曉杰，柴哲，楊鐘燕，等.藍莓酒發(fā)酵過程中抗氧化物質變化規(guī)律研究［J］.食品工業(yè)科技，2013，34（17）：103-105.

優(yōu)先數字出版時間：2016-06-16；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160616.1415.001.html。

中圖分類號：TS262.7；TS261.7；TS261.4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）07-0103-06

DOI：10.13746/j.njkj.2016150

基金項目：公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303073-01）。

收稿日期：2016-05-03

作者簡介：王瀅雪（1991-），女，碩士，研究方向為果酒釀造及檢測。

通訊作者：戰(zhàn)吉宬（1972-），男，教授，博士，研究方向為葡萄酒化學、葡萄生理生化與分子生物學；侯彩云（1963-），女，教授，博士，研究方向為食品安全檢測技術的研究與推廣。

Simultaneous Detection of 13 Kinds of Polyphenols in Fruit Wine by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography

WANG Yingxue，LIU Xueping，SUN Xiangyu，HOU Caiyun and ZHAN Jicheng
（Beijing Key Lab of Viticulture and Enology，College of Food Science and Nutritional Engineering，ChinaAgricultural University，Beijing 100083，China）

Abstract:A new method of RP-HPLC has been developed for simultaneous detection of 13 polyphenols（5 flavan-3-ols，4 flavonols，2 phenolic acids and 2 stilbene）in fruit wine.The separation was performed on a LiChrospher 100 RP-18e column at 30℃.The mobile phase was consisted of 0.1%phosphoric acid（A）and 0.1%phosphoric acid methanol（B），with gradient elution at a flow rate of 0.5 mL/min.The injection volume was 10 μL and a Photo-Diode Array（PDA）was used to monitor signals at 272 nm.Under these chromatographic conditions，13 polyphenols were successfully separated in 48 minutes and their contents showed good linear relationships with the peak areas，R2＞0.998.The method had the advantages of high recovery rate（73%～123%），good repeatability，good accuracy，and rapid detection.The contents of 13 polyphenols in six grape wine products，seven blueberry wine products，and five mulberry wine products were determined by this method.The results suggested that，13，10，and 9 polyphenols could be detected in grape wine，blueberry wine，and mulberry wine，respectively；the content of flavan-3-ols in grape wine was higher，on the other hand，the content of flavonols in blueberry wine and mulberry wine was higher；resveratrol was detected in grape wine and in mulberry wine，while there was no resveratrol in blueberry wine.This mehtod was suitable for the detection of mutiple phenolic compounds in various wine products.

Key words：fruit wine；polyphenols；RP-HPLC