吳旭鵬，郭玉剛，牛文斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154007)

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前列腺癌患者血清PCDH10甲基化檢測及臨床意義①

吳旭鵬，郭玉剛，牛文斌

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：通過測定前列腺癌患者及前列腺增生患者血清中PCDH10基因啟動子甲基化水平，探討其作為一種腫瘤標(biāo)志物對前列腺癌診斷的臨床價值。方法：收集20例前列腺癌患者和20例前列腺增生患者的血清樣本作為研究對象，應(yīng)用甲基化特異性聚合酶鏈式反映(MSP)方法，測定血清樣本中PCDH10基因甲基化狀態(tài)，同時分析20例前列腺癌患者的臨床資料。結(jié)果：20例前列腺癌患者中8例檢出PCDH10基因甲基化，20例前列腺增生患者中無一例檢出PCDH10基因甲基化。將檢測結(jié)果陽性和陰性兩類前列腺癌患者的拎出啊資料進行統(tǒng)計學(xué)分析。發(fā)現(xiàn)2類患者在年齡、前列腺特異性抗原(PSA值)、以及臨床Jewett分期的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但是在Gleason評分的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：PCDH10基因啟動子甲基化僅出現(xiàn)在前列腺癌患者血清中，而在前列腺增生(BPH)患者中未出現(xiàn)，并且PCDH10基因出現(xiàn)甲基化的比率與前列腺癌患者的Gleason評分呈正相關(guān)性。

關(guān)鍵詞：前列腺癌；PCDH10基因；甲基化；聚合酶鏈式反應(yīng)

不斷優(yōu)化前列腺癌的早期篩查條件是近幾年的臨床研究熱點。眾所周知，很多疾病的發(fā)生和發(fā)展，除環(huán)境因素外，還與患者自身的遺傳特性有著密切的關(guān)系。因此，在基因?qū)用鎸ふ仪傲邢侔┓肿訕?biāo)記物是人們自然而然想到的方法。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的基因位點被證明與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[1]。在腫瘤的基因檢測研究之初，各類癌基因以及抑癌基因的檢測樣本主要來源于腫瘤組織及各類腫瘤細胞系。直至1948年，血清中存在游離DNA被首次發(fā)現(xiàn)，大量的腫瘤工作者才將視線轉(zhuǎn)向血清標(biāo)本。目前已有多個研究證實前列腺癌組織標(biāo)本和前列腺癌細胞系中存在PCDH10基因及多種抑癌基因啟動子甲基化，但是這些變化是否會出現(xiàn)在血清中仍值得進一步探索。本研究將進一步檢測前列腺癌患者血清中PCDH10基因甲基化狀態(tài)極其臨床意義。

1.1樣本收集與處理

收集2014-01～2015-06在佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科住院治療的20例前列腺癌患者和20例前列腺增生患者的血樣本。所有患者均接受手術(shù)治療并由術(shù)后病理證實診斷。所有研究對象均登記年齡、PSA值、Jewett分期、Gleason分值。所有受試者于術(shù)前清晨空腹抽取靜脈血2mL，收集于抗凝管中。收集到的血標(biāo)本于4℃靜止2h，3000rpm/min離心10min，留取上清。所有標(biāo)本置于-80℃保存。

1.2DNA提取及修飾

取2.5mL血清，采用德國QIAGENamp Blood Mini kit試劑盒提取血清DNA，所有步驟均嚴格按照試劑盒上步驟逐步操作，最后以50μL DTT洗脫DNA，收集到的DNA使用紫外分光光度計測定波長在260nm處的OD值，計算DNA量，使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察DNA條帶以及亮度。收集到的DNA樣本置于-20℃保存?zhèn)溆?。亞硫酸鹽修飾采用Methylation-Gold Kit(ZYMO RESEARCH美國)，每0.5μg的DNA經(jīng)甲基化修飾后使用15μLDTT溶解，置于-20℃保存。

1.3甲基化特異性PCR

以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板，所有引物設(shè)計及合成均有上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及PCR反應(yīng)條件見表1。反應(yīng)體系為25μL：5X PCRbuffer5μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，10mmol/LdNTPs0.5μL,3U/μL Tap酶0.5μL，DNA模板1μL，補ddH2O 16μL。甲基化PCR反應(yīng)條件見表1。PCR結(jié)束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下觀察結(jié)果并截取圖片。

表1　MSP中PCDH10基因甲基化引物及退火條件

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

所需數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進行處理，以均數(shù)±標(biāo)準差表示，用卡方檢驗進行分析。P<0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1PCDH10基因在兩類不同患者血清學(xué)樣本中的MSP結(jié)果

20例前列腺癌患者中有8例患者血清中出現(xiàn)PCDH10基因甲基化(40%)，見圖1。20例前列腺增生患者血清中均未出現(xiàn)PCDH10基因甲基化。二者相比，PCDH10基因甲基化率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1　20例前列腺癌患者的血清PCDH10基因甲基化情況

2.2 血PCDH10基因甲基化與前列腺癌臨床資料之間的關(guān)系

進一步分析8例前列腺癌患者的臨床資料，并與剩下的12例陰性患者的臨床資料進行比對，發(fā)現(xiàn)兩組患者的Gleason評分具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與患者的年齡、PSA值和Jewett分期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2　PCDH10基因甲基化與前列腺癌臨床

3討論

前列腺癌是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤，很多患者在初診時即發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，因此尋找與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移浸潤相關(guān)的指標(biāo)一直是廣大臨床工作者的任務(wù)。目前為止，圍繞前列腺癌研究相關(guān)的血清學(xué)標(biāo)志物主要包括基因及蛋白兩個水平。近年來有人再次對前列腺癌患者的血清學(xué)樣本進行ELISA檢測，通過對血清中的EPCA-2指標(biāo)檢測及患者的臨床資料對比顯示，對于前列腺癌的診斷能力為EPCA-2>FPSA/TPSA>TPSA[2,3]。統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)即使診斷能力值最高的EPCA-2因子，其特異性依然無法達到100%。而基因診斷中極高的特異性體現(xiàn)出很高的優(yōu)勢，位于腫瘤抑制基因啟動子區(qū)域的CpG島的高度甲基化，是一個重要的基因失活機制。這一改變會破壞細胞信號通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤演進，該機制幾乎存在于所有腫瘤中[4]。DNA甲基化是一種重要的是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因表達沉默的表觀遺傳學(xué)方式，DNA甲基化可是miRNA表達失調(diào)[5]。抑癌基因的異常甲基化導(dǎo)致抑癌基因沉默或失活，是造成腫瘤抑制能力喪失的重要原因，與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。

PCDH10(OL-PCDH或KIAA1400)是原鈣粘蛋白家族的新成員，該基因位于4q22.2，有5個外顯子組成，長約42.26kb[6]。通過生物信息學(xué)分析、定向克隆、定點突變和雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)等技術(shù)和方法，將人PCDH10基因的核心啟動子系列定位于轉(zhuǎn)錄起始點上游的一段富含CpG島的區(qū)域內(nèi)[7]。近年來有人進一步檢測了PCDH10mRNA在人體組織中的表達特征，采用熒光定量PCR檢測PCDH10mRNA在人體組織中的表達情況，結(jié)果顯示在前列腺組織中表達量最高，睪丸及腎次之[8]。 此進一步研究前列腺癌患者血清中PCDH10基因啟動子甲基化狀態(tài)具有十分重要的意義。

本研究顯示，20例前列腺癌患者中有8例檢出PCDH10基因啟動子甲基化，而20例前列腺增生患者無一例檢出，特異性為100%，敏感性為40%。同時我們發(fā)現(xiàn)只有40%的前列腺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)PCDH10基因啟動子甲基化，較相關(guān)針對前列腺癌組織樣本進行的MSP研究分析所得的60%的陽性率[9]有一定差距，這種現(xiàn)象可能與組織釋放至血循環(huán)的DNA量較少有關(guān)。進行PCR擴增時，作為模板的DNA如果含量不足或濃度太低引起MSP檢測靈敏度受限。

進一步分析前列腺癌患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)陽性組與陰性組患者的Gleason評分差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，這種現(xiàn)象可能是Gleason評分較高的前列腺癌患者自身的腫瘤細胞凋亡速度比較快，以及腫瘤組織隨血液進入血循環(huán)的總量增加有關(guān)，故釋放至循環(huán)血液中的DNA量較多。隨著釋放入血液中的DNA量增加，基因的甲基化進一步影響著PCDH10基因的表達，所以血清中PCDH10基因啟動子甲基化研究相對于組織樣本和前列腺癌細胞系的研究對于前列腺癌的臨床診斷意義更大。

不過我們依然可以看到抑癌基因啟動子甲基化檢測針對前列腺癌診斷的特異性雖然較高，但比較相比傳統(tǒng)的蛋白水平檢測，其敏感性較低，這可能是由于技術(shù)上的不足，造成的血清樣本基因提取和修飾過程中造成的大量DNA丟失有關(guān)。不過相信在基因工程飛速發(fā)展的今天，該項技術(shù)水平的不足將會很快被彌補。

參考文獻：

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基金項目：①黑龍江省自然基金項目，編號：D201225。

作者簡介：吳旭鵬(1989～)男，山西晉城人，在讀碩士研究生。 通訊作者：牛文斌(1972～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:niuwenbin@sina.com。

中圖分類號：R814.42；R737.25

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-0104(2016)04-0120-02

(收稿日期：2016-03-08)