王桂梅，王彩霞，聶美楠，刁為英，郭夢凡，呂淑慧

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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RegⅣ、VEGF-C在結腸癌中的表達及意義①

王桂梅，王彩霞，聶美楠，刁為英，郭夢凡，呂淑慧

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要:目的:研究RegⅣ和VEGF-C、D2-40在結腸癌組織中的表達，并探討RegⅣ與淋巴管新生的關系。方法:采用免疫組化方法檢測60例結腸癌和20 例正常結腸組織中 RegⅣ 和VEGF-C表達情況，并用D2-40標記微淋巴管，計數(shù)微淋巴管密度(Lymphatic microvessel density，LMVD)。結果: RegⅣ 和VEGF-C在結腸癌中高表達，與正常組比較有顯著性差異,并且兩者呈正相關。D2-40 表達的 LMVD 計數(shù)在結腸癌組顯著增加(P<0.05)。結論:結腸癌組織RegⅣ 和VEGF-C高表達并呈正相關性，說明兩者共同促進了結腸癌的發(fā)生和發(fā)展，VEGF-C是淋巴管生成的調控因子，結腸癌組織中微淋巴管密度增加，推測RegⅣ可能間接的促進了微淋巴管的形成，促進了結腸癌的轉移，為結腸癌的治療思路提供了參考。

關鍵詞:結腸癌； RegⅣ；VEGF-C；D2-40；微淋巴管密度

再生基因家族成員Ⅳ(Regenerating islet-derived family, member 4, RegⅣ)是小的分泌蛋白，參與細胞的增殖和再生。它也是癌癥和炎癥性腸病的候選標記，并與神經(jīng)內分泌和腸分化有關[1]。結腸癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率正在上升，其主要致死因素是快速增殖及出現(xiàn)局部和遠處轉移[2]。血管/淋巴管新生在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)、侵襲及轉移過程中發(fā)揮重大作用。血管內皮生長因子家族(vascular endothelial growth factors,VEGFs)是血管/淋巴管新生最主要的調控因子，其中VEGF-C是淋巴管新生重要的調控因子。RegⅣ在消化道疾病中的研究已有部分研究，但是其與淋巴管新生的關系尚未見報道，我們探討RegⅣ與淋巴管新生的關系，以期為預防結腸癌發(fā)展和轉移提供新的思路。

1材料與方法

1.1材料

隨機選取我院2010～2014年間的結腸癌蠟塊60例，術前均未經(jīng)任何治療。請兩名病理醫(yī)生復閱切片并驗證診斷。對照組20例來源于距離癌組織大于5 cm并經(jīng)病理學證實的癌旁正常結腸組織。結腸癌患者年齡35～78歲，平均(56.5±1.5)歲，男31例，女29例。臨床分期:T1+T2共23例，T3+T4共37例 ；分化程度：中-低分化41例，高分化19例；淋巴結轉移：發(fā)生轉移 42例，沒有發(fā)生轉移18例；腫瘤直徑：小于5cm者 32例，大于或等于5cm 者28例。

1.2主要試劑

羊抗人RegⅣ多克隆抗體、兔抗人VEGF-C多克隆抗體(美國Santa cruz公司)，小鼠抗人D2-40單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.3方法

采用EnVision法進行免疫組化染色，檢測RegⅣ,VEGF-C，D2-40在正常結腸、結腸癌組織中的表達情況，并計數(shù)D2-40陽性的微淋巴管密度(LMVD)。染色步驟按EnVision試劑盒說明進行，判讀結果。

1.4判斷標準

RegⅣ 、VEGF-C的陽性定位于細胞質，呈淡黃色或黃褐色。

LMVD計數(shù)參考Weidner等的方法: D2-40染色陽性的單個內皮細胞或內皮細胞簇計為一個陽性微淋巴管,不一定要有完整的管狀結構,在低倍鏡(100×)下先選取微淋巴管最豐富的區(qū)域,然后在(200×)視野下計數(shù)LMVD,每例計數(shù)5個視野,并求其均值。

1.5統(tǒng)計學方法

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。各組間陽性率的比較采用χ2檢驗，組間比較用t檢驗，相關性分析采用 Spearman 等級相關檢驗。

2結果

2.1RegⅣ、VEGF-C在結腸癌中的表達

RegⅣ和VEGF-C陽性表達均定位于細胞漿，呈淡黃色或棕黃色(圖1～4)，結腸癌組共有35例表達RegⅣ，陽性率為58.3%，正常組有1例表達RegⅣ，陽性率為5%。結腸癌組有40例表達VEGF-C，陽性率為66.7%，正常組有3例表達VEGF-C，陽性率為10%，結腸癌組與正常組比較有顯著性差異,見表1。

表1　RegⅣ、VEGF-C在結腸癌及正常結腸組織中的表達

與對照組比較，＊P<0.05。

圖1　RegⅣ在結腸癌中的陽性表達(×100)

圖2　VEGF-C在結腸癌中的陽性表達(×100)

圖3　RegⅣ在結腸癌中的陰性表達(×100)

圖4　VEGF-C在結腸癌中的陰性表達(×100)

2.2RegⅣ與VEGF-C在結腸癌中表達的相關性

60例結腸癌組織中，RegⅣ陽性35例，(其中VEGF-C陽性28例，陰性9例)，RegⅣ陰性25例(其中VEGF-C陽性9例，陰性16例)。經(jīng)Spearman等級相關性分析顯示，RegⅣ與VEGF-C表達呈正相關(P<0.05)。

2.3結腸癌組與正常組D2-40標記的微淋巴管的關系

結腸癌組織和正常結腸組織中均可見D2-40陽性標記的淋巴管, 形狀不規(guī)則,為擴張狀或閉鎖條索狀,管壁較薄,多由單層內皮組成。正常結腸黏膜固有層中未見明確微淋巴管，固有層底部及黏膜下層可見少量擴張的微淋巴管。結腸癌組織間淋巴管較少，癌旁間質內微淋巴管增多，正常組微淋巴管5.33±1.80，結腸癌組微淋巴管31.39±10.60，兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3討論

結腸癌浸潤和轉移是導致結腸癌患者死亡的主要原因，血管/淋巴管新生在腫瘤的形成和轉移中起著至關重要的作用。VEGF-C是血管內皮生長因子家族(vascular endothelial growth factors,VEGFs)成員，是淋巴管生成主要的調節(jié)因子。VEGFR-3是VEGF-C的特異性受體，屬于酪氨酸激酶受體家族成員，VEGF-C與VEGFR-3結合后，可誘導VEGFR-3酪氨酸激酶磷酸化，促進淋巴管內皮細胞的增殖和遷移，與LVD增加、浸潤和淋巴結轉移顯著相關[3]。

D2-40是淋巴管內皮細胞特異性標記物，通過免疫組化標記淋巴管內皮檢測微淋巴管密度(Lymphatic microvessel density,LMVD)來反應淋巴管新生的活躍程度。部分惡性腫瘤中淋巴管調控因子的蛋白表達和LMVD與淋巴結轉移相關。D2- 40主要表達于淋巴管內皮，陽性部位為淋巴管內皮細胞質,呈棕黃色。

再生基因家族成員4(regenerating islet-derived family, member 4, RegⅣ)是Reg家族最新的成員，最初是通過炎癥性腸病cDNA文庫高通量測序確定的[1]。RegⅣ在人類胃腸道惡性腫瘤中表達上調，它可以增加抑制凋亡相關的蛋白質Bcl-2、Bcl-xl和 survivin的表達，并能有效激活結腸腺癌EGFR/Akt/ AP -1信號通路， Reg信號中斷對于人類胃腸道腺癌的治療干預可能是有效的[4]。RegⅣ還是人類結直腸癌細胞分裂和增殖的關鍵調控因子，其誘導的有絲分裂涉及Akt-GSK3β-β-Catenin-TCF-4信號，是人類結直腸癌治療的潛在靶點[5]。

RegⅣ在女性生殖系統(tǒng)中的研究已有報道，杜芳等應用免疫組化、定量RT-PCR 和 Western blotting 的檢測方法顯示RegⅣ可以在正常大鼠的卵巢中表達，多囊卵巢綜合征時表達下降，推測RegⅣ與卵泡顆粒細胞的增殖、凋亡及卵泡的發(fā)育成熟與和閉鎖有一定的關系[6]。

胥瑾[7]等通過 RNA 體外干擾技術下調胃癌細胞株中的 REG4的表達，結果提示REG4 基因具有促胃癌細胞生長，抑制胃癌細胞凋亡的作用，干擾 REG4 基因表達可以抑制胃癌細胞增殖，促進胃癌細胞凋亡。有研究顯示[8]，在大腸癌組織中高表達RegⅣ蛋白，用PCR測定大腸癌中RegⅣ基因的表達顯著高于正常組織。這與我們的研究結果相似。但是RegⅣ在對于腫瘤的脈管生成是否有影響，其可能的機制是什么，尚未見有報道。我們的研究結果顯示結腸癌組織中RegⅣ與VEGF-C的表達升高并呈正相關，結腸癌組織中微淋巴管的數(shù)量明顯增多，由此推測RegⅣ和VEGF-C共同參與了結腸癌的發(fā)生和發(fā)展，可能是通過促進微淋巴管的新生而促進了結腸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移，其作用機制尚有待于進一步研究。

參考文獻:

[1]Hartupee JC, Zhang H, Bonaldo MF, et al. Isolation and characterization of a cDNA encoding a novel member of the human regenerating protein family:RegIV[J]. Biochim Biophys Acta, 2001,1518(3):287-293

[2]湯釗猷.現(xiàn)代腫瘤學[M].上海:上海醫(yī)科大學出版社,2000:251-275

[3]Yu XM, Lo CY, Chan WF, et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor C in papillary thyroid carcinoma correlates with cervical lymph node metastases[J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(22):8063-8069

[4]Bishnupuri KS, Luo Q, Murmu N,et al. Reg IV activates the epidermal growth factor receptor/Akt/AP-1 signaling pathway in colon adenocarcinomas[J]. Gastroenterology, 2006,130(1):137-149

[5]Bishnupuri KS, Sainathan SK, Bishnupuri K, et al. Reg4-induced mitogenesis involves Akt-GSK3β-β-Catenin-TCF-4 signaling in human colorectal cancer[J].Mol Carcinog,2014, 53(01):169-180

[6]杜芳,王繼東,姚珍薇.再生基因Reg IV在多囊卵巢綜合征(PCOS)模型大鼠卵巢中的表達[J].生殖與避孕，2012,32(11):721-727

[7]胥瑾，耿排力, 呂有勇.體外 RNA 干擾抑制 REG4 基因表達對胃癌細胞增殖及凋亡的影響[J].青海醫(yī)學院學報,2012,33(1):27-30

[8]Zheng HC,Sugawara A,Okamoto H,et al.Expression profile of the REG gene family in colorectal carcinoma[J].Histochem Cytochem,2011,59(1):106-115

基金項目:①黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題，編號:2014-238。

作者簡介:王桂梅(1980～) 女，黑龍江佳木斯人，碩士，主治醫(yī)師。

中圖分類號:R735．3+5

文獻標識碼:A

文章編號：1008-0104(2016)04-0091-02

(收稿日期：2016-01-20)