邵文武，辛　華，于海東，王　琳，劉君星

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響①

邵文武1，辛華2，于海東2，王琳2，劉君星1

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：觀察不同區(qū)正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用，并探討其對(duì)糖代謝水平的影響。方法：抽取2012-03～2013-11本院在激素下培養(yǎng)的非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145作為研究樣本，正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞分別選擇外周帶組織以及移形帶組織，經(jīng)體外培養(yǎng)后抽取培養(yǎng)液上清液進(jìn)行DU145細(xì)胞的培養(yǎng)，并采用MTT法測(cè)定不同區(qū)位下前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的抑制效果，并采用Western印跡法對(duì)前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，分析不同區(qū)位下間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖化代謝水平的影響。結(jié)果：A組的前列腺癌細(xì)胞數(shù)目(125±14)×104個(gè)明顯高于B組的(78±6)×104個(gè)與對(duì)照組的(57±3)×104個(gè)，B組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；A組的LDHA、PKM-2、PDH、HK-2水平顯著高于B組與對(duì)照組，組間比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組的LDHA、PDH、HK-2水平顯著低于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：不同區(qū)帶下的間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及糖代謝具有不同的作用，外周帶間質(zhì)細(xì)胞具有生長(zhǎng)及糖代謝促進(jìn)作用，而移行帶間質(zhì)細(xì)胞則起到一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞：前列腺間質(zhì)細(xì)胞；前列腺癌；糖代謝水平

前列腺癌屬于老年人的常發(fā)惡性腫瘤，在老齡化加劇的社會(huì)結(jié)構(gòu)下，該病的發(fā)病率也逐漸攀升。其發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床通常借助高分子量細(xì)胞角蛋白、前列腺特異基因DD3、Pca224蛋白等對(duì)其進(jìn)行篩查診斷。近年來(lái)有研究表明，糖基化終產(chǎn)物受體也與前列腺癌的病癥機(jī)理有一定的聯(lián)系[1]。解剖學(xué)中將前列腺劃分為中央帶、外周帶以及移行帶，然而已有學(xué)者提出，在不同的區(qū)位下具有不等的前列腺癌發(fā)病率，同時(shí)，前列腺細(xì)胞的糖代謝水平也有所差異[2]。本文則將激素下培養(yǎng)的非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145作為研究樣本，分別對(duì)外周帶組織以及移行帶組織中正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞的影響作用進(jìn)行對(duì)照分析，報(bào)道如下。

1材料與方法

1.1一般材料

抽取2012-03～2013-11本院在激素下培養(yǎng)的非依賴性前列腺癌細(xì)胞DU145作為研究樣本，正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞分別選擇外周帶組織以及移形帶組織。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

選用美國(guó)Gibeo公司生產(chǎn)的DMEM培養(yǎng)液(10%的胎牛血清、100U/mL的鏈霉素、100U/mL的青霉素)，將實(shí)驗(yàn)樣本DU145細(xì)胞株溶于其中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境：5%的二氧化碳濃度以及37℃的溫度。分別在外周帶以及移行帶的間質(zhì)細(xì)胞下對(duì)DU145細(xì)胞進(jìn)行條件培養(yǎng)，12h后取的上清液。將DMEM培養(yǎng)液與DU145細(xì)胞以1:1的比例進(jìn)行配比，再進(jìn)行培養(yǎng)。此時(shí)，可將條件培養(yǎng)出的細(xì)胞提取待檢。以DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照組，外周帶間質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)的細(xì)胞作為A組，移行帶間質(zhì)細(xì)胞天劍培養(yǎng)的細(xì)胞作為B組。

1.2.2MTT法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的DU145細(xì)胞，沖洗消化后，將其與96孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行接種，1×104個(gè)細(xì)胞每孔，并于孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，保持5%的二氧化碳濃度以及37℃的箱溫。之后，取不同間質(zhì)細(xì)胞下培養(yǎng)的DU145細(xì)胞分別加入MTT溶液，0.5mg/mL的MTT溶液15μL每孔。再將其置于5%的二氧化碳濃度以及37℃的箱溫下培育4h，去除培養(yǎng)液，在將DMSO分別加入每孔中，100μl每孔。10min后分別對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.2.3Western印跡法檢測(cè)

選用細(xì)胞裂解液對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行裂解反應(yīng)，其中包含HEPES 25mmol/L、EDTA 2mmol/L、NaCl 137mmol/L、Na3Vo4 1mmol/L、β-磷酸甘油 3mmol/L、EGTA 1mmol/L[3]。30min后進(jìn)行離心處理，14000r/min，20min后取上清液，將5X SDS加入其中，置于98℃的環(huán)境下進(jìn)行變性處理，5min后再次進(jìn)行離心處理，13000r/min，1min后加入SDS-PAGE對(duì)其進(jìn)行分離處理，并采用半干法轉(zhuǎn)膜，持續(xù)1h，再將其置于封閉環(huán)境下加入5%的脫脂奶粉，采用TBST溶液進(jìn)行沖洗，5min一次，分別清洗3次。再進(jìn)行抗體的孵育以及染色處理，以1:1000的比例孵育一抗，置于4℃的溫度下過(guò)夜處理；以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記1:2000的比例孵育二抗，并將其置于37℃的的室溫下，1h后進(jìn)行X曝光，分析顯影定影效果[4]。

1.3觀察指標(biāo)

①觀察不同區(qū)間質(zhì)細(xì)胞對(duì)DU145細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響，比較三組培養(yǎng)液中前列腺癌細(xì)胞的增殖數(shù)量。②不同間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響，分別比較乳酸脫氫酶(LDHA)、丙酮酸激酶2(PKM-2)、丙酮酸脫氫酶(PDH)以及已糖激酶2(HK-2)的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1三組培養(yǎng)液對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖數(shù)量的比較

A組的前列腺癌細(xì)胞明顯高于B組與對(duì)照組，B組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　三組培養(yǎng)液對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖數(shù)量的比較±s)

注：1.A組與B組相比，t=7.558，aP<0.05；A組與對(duì)照組相比，t=11.633，cP<0.05。2.與對(duì)照組相比，t=7.668，bP<0.05。2.2不同間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響

A組的LDHA、PKM-2、PDH、HK-2水平顯著高于B組與對(duì)照組，組間比較差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；B組的LDHA、PDH、HK-2水平顯著低于對(duì)照組，組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2　不同間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響

注：1.與B組相比，*P均<0.05；2.與對(duì)照組相比，#P均<0.05；3.與對(duì)照組相比，**P均<0.05。

3討論

隨著前列腺癌的發(fā)病率逐漸升高，世界各國(guó)的臨床學(xué)者也加大了對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的研究。近年來(lái)，有學(xué)者研究指出前列腺癌的形成與細(xì)胞的糖代謝水平有一定的關(guān)聯(lián)性。且在不同區(qū)的間質(zhì)細(xì)胞下存在不同的前列腺癌發(fā)病率。有學(xué)者通過(guò)將前列腺間質(zhì)細(xì)胞與LNCaP細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞對(duì)細(xì)胞的增殖具有一定的影響。也有學(xué)者將外周帶與移行帶組織的間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的作用進(jìn)行研究，可見在外周帶組織的間質(zhì)細(xì)胞下，癌細(xì)胞具有較快的增殖速度，起到一定的促進(jìn)作用；而在移行帶組織的間質(zhì)細(xì)胞下，癌細(xì)胞的增殖速度較慢，具有一定的抑制作用[5]。本次試驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)首先對(duì)不同間質(zhì)下前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察，A組的前列腺癌細(xì)胞數(shù)目(125±14)×104個(gè)明顯高于B組的(78±6)×104個(gè)與對(duì)照組的(57±3)×104個(gè)，B組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組，提示外周帶組織下的間質(zhì)細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖具有促進(jìn)作用，加快了癌細(xì)胞的生長(zhǎng)分化，而移行帶則起到較好的抑制作用，此區(qū)間下前列腺癌的發(fā)病率較低。進(jìn)而，再觀察不同間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響，A組的LDHA、PKM-2、PDH、HK-2水平顯著高于B組與對(duì)照組，B組的LDHA、PDH、HK-2水平顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明外周帶間質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)了糖代謝分化，糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平較高，而移行帶間質(zhì)細(xì)胞則使得糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平較低。本次研究結(jié)果與劉棚越[6]等學(xué)者的研究結(jié)果一致，具有較高的臨床意義。

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[6]劉棚越,周娟,彭御冰,等.正常前列腺間質(zhì)細(xì)胞對(duì)前列腺癌細(xì)胞糖代謝水平的影響[J].中華男科學(xué)雜志,2015,21(6):489-493

基金項(xiàng)目：①1.黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目，編號(hào)：D201225；2.佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)重點(diǎn)項(xiàng)目，編號(hào)：12Z1201504。

作者簡(jiǎn)介：邵文武(1970～)男，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，副教授。 通訊作者：辛華(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任技師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:xh70128@163.om。

中圖分類號(hào)：R737.25

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0077-02

(收稿日期：2015-12-12)