倪　蕾，張西凱，侯志凌，楊　玉，梁衍峰，于廣晴

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

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Wee1抑制劑聯(lián)合阿霉素對(duì)急性白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用①

倪蕾1，張西凱1，侯志凌1，楊玉2，梁衍峰2，于廣晴1

(1.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

摘要：目的：研究應(yīng)用Wee1抑制劑PD0166285聯(lián)合阿霉素對(duì)急性白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制。方法：以人急性白血病細(xì)胞株HL60、NB4、EOL-1為研究對(duì)象，采用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)PD0166285和阿霉素對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果：?jiǎn)为?dú)用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，PD0166285或者阿霉素對(duì)HL60、NB4、EOL-1均有不同程度的生長(zhǎng)抑制作用，并呈明顯的濃度一效應(yīng)關(guān)系。聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD0166285和阿霉素聯(lián)用后對(duì)HL60、EOL-1細(xì)胞株的抑制率顯著增加，明顯高于單一用藥，且有顯著差異(P<0.05)，對(duì)NB4細(xì)胞株的抑制率也增加，但無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)論：相對(duì)于單獨(dú)應(yīng)用PD0166285或者阿霉素，PD0166285聯(lián)合阿霉素增強(qiáng)了對(duì)急性白血病細(xì)胞株HL60、EOL-1的生長(zhǎng)抑制作用。

關(guān)鍵詞：Wee1抑制劑； 阿霉素； 白血??； 增殖抑制； MTT

阿霉素(Adriamycin，ADM；多柔比星，Doxorubicin，DXR)作為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的一種代表，在多種腫瘤尤其急性白血病的治療中參與組成聯(lián)合化療方案，具有良好的療效。阿霉素通過(guò)嵌入到DNA雙鏈之間并緊密結(jié)合到DNA上形成穩(wěn)定的復(fù)合物，破壞DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)胞DNA以及DNA依賴性RNA的合成[1]。阿霉素作為一種細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物, 細(xì)胞毒作用可發(fā)生于各期細(xì)胞，但耐藥性和藥物毒性限制了其在臨床的應(yīng)用[2]。Wee1蛋白激酶是調(diào)控細(xì)胞從G2期到M期的關(guān)鍵靶點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，PD0166285作為一種Wee1蛋白激酶抑制劑可協(xié)同化療或放療共同發(fā)揮抗腫瘤作用[3，4]。我們希望通過(guò)檢測(cè)PD0166285聯(lián)合阿霉素對(duì)急性白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制影響，以證實(shí)兩藥聯(lián)用是否具有協(xié)同作用，從而為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)[5]。

1材料和方法

1.1藥物和試劑

Wee1抑制劑PD0166285(由日本高知大學(xué)第三內(nèi)科提供)，Doxorubicin(Sigma公司)均溶于100%二甲基亞砜(DMSO)配制成10-2M于-80℃下保存。臨用前用RPMI1640調(diào)至所需濃度。小牛血清(FBS)：Sigma公司產(chǎn)品，56 ℃水浴30min滅活后分裝，4℃保存。RPMI1640：Sigma公司產(chǎn)品，4℃保存。MTT粉劑：Sigma公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞株及其培養(yǎng)

HL60細(xì)胞株(AML)、NB4細(xì)胞株(APL)、EOL-1細(xì)胞株(eosinophilic leukemia cell line)(均由日本高知大學(xué)第三內(nèi)科提供)。HL60、NB4、EOL-1細(xì)胞株按常規(guī)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法接種于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，2～3d換液一次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3細(xì)胞活力測(cè)定(MTT法)

本實(shí)驗(yàn)分單一用藥實(shí)驗(yàn)和聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)兩部分。單一藥物作用實(shí)驗(yàn)設(shè)PD0166285實(shí)驗(yàn)組、阿霉素實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組, PD0166285的濃度范圍為0.005～1μM/mL、阿霉素的濃度范圍為0.03～10μM/mL。根據(jù)單一用藥對(duì)HL-60、NB4、EOL-1作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇抑制率在10%～30%左右的PD0166285、阿霉素濃度作為聯(lián)合用藥的濃度,作用48h后用MTT法測(cè)定PD0166285、阿霉素單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HL-60、NB4、EOL-1細(xì)胞的增殖抑制作用,計(jì)算抑制率并求得半數(shù)抑制濃度(IC50)。

將HL60細(xì)胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為0.25～1μM，阿霉素的濃度范圍為0.1～1μM；將NB4細(xì)胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為0.125～0.5μM，阿霉素的濃度范圍為1～10μM；將EOL-1細(xì)胞(2×105/mL)接種于96孔板，每孔體積為100μL，每孔分別加入不同倍比稀釋濃度的藥物，PD0166285的濃度范圍為3～30nM，阿霉素的濃度范圍為30～300nM。以上實(shí)驗(yàn)組每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行孔，同時(shí)用RPMI1640替代藥物作為空白對(duì)照，將鋪好的96孔板置于含5% CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育48h，然后每孔加入5mg/mLMTT液10μL再孵育1h，加入20%SDS溶解紫瓚晶體后置于微量光譜測(cè)量?jī)x器570nm處測(cè)吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次取其中三次的平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

單獨(dú)用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PD0166285、阿霉素對(duì)HL60、NB4、EOL-1細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，并呈明顯的濃度—效應(yīng)關(guān)系。PD0166285作用于HL60、EOL-1細(xì)胞48h的IC50分別為1μM、0.08μM，作用NB4相對(duì)較弱，48h未達(dá)到IC50(圖1)；阿霉素作用于HL60、NB4、EOL-1細(xì)胞48h的IC50分別為0.65μM、8μM、0.25μM(圖2)。

聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：PD0166285聯(lián)用阿霉素增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用。例如，單獨(dú)應(yīng)用PD0166285 (0.25μM，48h)或者阿霉素(1μM，48 h)，對(duì)HL60細(xì)胞株的抑制率分別為(33±1)% 、(63±0.002)%；當(dāng)二者聯(lián)合時(shí)，抑制率可達(dá)(77±0.2)%(P<0.05)(圖3)。同樣的，單獨(dú)應(yīng)用PD0166285(30 nM，48h)或者阿霉素(100nM，48h)，對(duì)EOL-1細(xì)胞株的抑制率分別為(53±4)% 、(57±4)%；當(dāng)二者聯(lián)合時(shí)，抑制率可達(dá)(74±4)%(P<0.05) (圖4)。PD0166285聯(lián)合阿霉素也同樣增強(qiáng)了對(duì)NB4細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用，但無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖5)。

圖1　PD0166285對(duì)HL60、NB4、EOL-1細(xì)胞增殖抑制(MTT法)

圖2阿霉素(Doxorubicin)對(duì)HL60、NB4、EOL-1細(xì)胞增殖抑制(MTT法)

圖3PD0166285聯(lián)用阿霉素對(duì)HL60細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

圖4PD0166285聯(lián)用阿霉素對(duì)EOL-1細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

圖5PD0166285聯(lián)用阿霉素對(duì)NB4細(xì)胞株的生長(zhǎng)抑制作用(MTT法)(*P<0.05，**P<0.01)

3討論

參與細(xì)胞周期調(diào)控的分子靶向治療已經(jīng)成為目前腫瘤治療研究的焦點(diǎn)。Wee1蛋白激酶作為一種細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)因子，屬于蛋白激酶中絲氨酸/蘇氨酸家族的一員。Wee家族包括Wee1-A，Wee1-B和MYT1三種蛋白激酶，Wee1-A主要存在于體細(xì)胞中，Wee1-B主要存在于胚胎細(xì)胞中，而MYT1在體細(xì)胞和胚胎細(xì)胞中均存在。Wee1激酶最初的研究源于酵母，是一種細(xì)胞分裂周期的突變體，在酵母中呈低表達(dá)。人類Wee1激酶是調(diào)控細(xì)胞周期從G2期到M期的關(guān)鍵靶點(diǎn)。在細(xì)胞周期進(jìn)入有絲分裂之前，Wee1激酶促使其完成DNA損傷修復(fù)和DNA復(fù)制。Wee1在細(xì)胞周期的S期和G2期十分活躍，可通過(guò)使Cdc2的Tyr-15位點(diǎn)磷酸化繼而降低Cdc2激酶的生物活性，最后可特異地調(diào)控細(xì)胞周期和有絲分裂。Wee1基因缺失或表達(dá)受抑后，致使相關(guān)的細(xì)胞周期激酶被激活，使細(xì)胞DNA損傷無(wú)法得到修復(fù)而直接進(jìn)入下一細(xì)胞周期，可進(jìn)一步導(dǎo)致DNA損傷細(xì)胞出現(xiàn)有絲分裂災(zāi)難，甚至出現(xiàn)細(xì)胞凋亡或死亡等[6]。伴有p53失活的腫瘤經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞周期G1檢查點(diǎn)缺失，使細(xì)胞DNA復(fù)制及損傷修復(fù)過(guò)程中更加依賴于細(xì)胞周期G2/M期檢查點(diǎn)的修復(fù)功能，因而作為細(xì)胞周期G2/M期檢查點(diǎn)的關(guān)鍵因子，Wee1蛋白激酶成為了潛在的具有抗腫瘤作用的靶點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外報(bào)道顯示wee1抑制劑已經(jīng)在肺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤等多種腫瘤試驗(yàn)中被證明可以加強(qiáng)放化療的作用。WANG等[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wee1被siRNA沉默后的HeLa細(xì)胞更容易被阿霉素殺死，但正常的宮頸上皮細(xì)胞卻無(wú)明顯損傷。Hashimoto等[8]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)WEE1抑制劑PD0166285可使B16黑色素瘤細(xì)胞從G2期阻滯變?yōu)镚1期阻滯并抑制細(xì)胞增殖，促使細(xì)胞死亡。SCHELLENS等[9]通過(guò)研究證明Wee1小分子抑制劑MK-1775既可以作為單獨(dú)藥物應(yīng)用，也可以與卡鉑、順鉑、吉西他濱等化療藥物聯(lián)用，均對(duì)多種實(shí)體腫瘤有明顯抑制作用。WANG等[4,10]進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wee1抑制劑PD0166285可以協(xié)同化療或放療增強(qiáng)對(duì)肺癌、結(jié)腸癌和黑色素瘤患者腫瘤細(xì)胞的殺傷，從而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生有絲分裂災(zāi)難，甚至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。阿霉素作為蒽環(huán)類抗腫瘤藥物的一種代表，是多種腫瘤尤其急性白血病的化療方案的重要組成藥物，使用廣泛，能夠嵌合于DNA堿基對(duì)之間并緊密地結(jié)合到DNA上，這種嵌合可破壞DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而抑制DNA以及DNA依賴性RNA的合成。阿霉素作為一種細(xì)胞周期非特異性抗腫瘤藥物, 對(duì)各期細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用，但以S期細(xì)胞對(duì)其最敏感。然而，DNA損傷后會(huì)通過(guò)激活相關(guān)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)而使細(xì)胞周期停滯，為細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)提供時(shí)間并促使細(xì)胞經(jīng)過(guò)修復(fù)而存活。因此，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的激活可能是導(dǎo)致阿霉素等蒽環(huán)類藥物治療急性白血病失敗的原因之一。

為此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Wee1抑制劑PD0166285聯(lián)合阿霉素，觀察作用環(huán)節(jié)及作用機(jī)理各不相同的藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)急性白血病細(xì)胞的增值抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PD0166285和阿霉素聯(lián)用后對(duì)HL60、EOL-1細(xì)胞株的抑制率顯著增加，明顯高于單一用藥，且有顯著差異(P<0.05)。綜上所述，PD0166285聯(lián)用阿霉素不僅能提高抗白血病作用，而且可望降低阿霉素的用量而減少相關(guān)副作用，聯(lián)合運(yùn)用PD0166285與阿霉素可望成為治療白血病新的有效方案。PD0166285和阿霉素聯(lián)用對(duì)HL60、EOL-1細(xì)胞株的抑制有協(xié)同作用。PD0166285聯(lián)用阿霉素不僅能提高抗白血病作用，而且可望降低阿霉素的用量而減少相關(guān)副作用，聯(lián)合運(yùn)用PD0166285與阿霉素可望成為治療白血病新的有效方案。

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作者簡(jiǎn)介：①倪蕾(1983～)女，黑龍江佳木斯人，主治醫(yī)師。 通訊作者:于廣晴(1956～)男，河北博野人,主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:YuGuangqing1956@163.com。

中圖分類號(hào)：R557

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0055-03

(收稿日期：2015-12-01)

Wee1 inhibitor PD0166285 and Doxorubicin induce growth arrest of AML cell lines by MTT assay

NILei1,ZHANGXi-kai1,HOUZhi-ling1,YANGYu2,LIANGYan-feng2,YUGuang-qing1

(1.The First Hospital Affiliated to Jiamusi University, Jiamusi 154003,China; 2. Basic Medical College, Jiamusi University, Jiamusi 154007,China)

Abstract:Objective: To investigate the effects of Wee1 inhibitor PD0166285 and Doxorubicin induce growth arrest of AML cell lines by MTT assay．Methods: Taking human AML cell line HL60, NB4, EOL-1 as the research objects, we investigated the inhibition of PD0166285 and Doxorubicin on cell growth by MTT Assay. Results: The results of solo-medication group showed that PD0166285 and Doxorubicin inhibited the growth of HL60、NB4、EOL-1 cells in a dose-dependent manner. The results of combined-medication group showed that PD0166285 and Doxorubicin which used in combination inhibited the growth of HL60、EOL-1 cells. The inhibition was more obvious in the combination group than in the solo-medication group(P<0.05). The inhibition of the growth of NB4 cells was not obvious in the combination group than in the solo-medication group(P>0.05). Conclusions: The inhibition of the growth of HL60, EOL-1 cells was more obvious in the combination group of PD0166285 and Doxorubicin than in the solo-medication group.

Key words:Wee1 Inhibitor; Doxorubicin; leukemia; proliferation inhibition; MTT