許海英，顏　玉，姜　威，陳　剛

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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益生菌聯(lián)合美沙拉嗪對(duì)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎Claudin-1及TLR4的影響①

許海英，顏玉，姜威，陳剛

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的:觀察益生菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸組織中Claudin-1及TLR4的影響。方法：將SD大鼠32只隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組。對(duì)照組自由飲水7d，模型組及其他各組給予自由飲用5%的葡聚糖硫酸鈉溶液(DSS)7d以制備UC模型。后各組給予相應(yīng)干預(yù)措施，7d后處死各組大鼠，HE染色觀察結(jié)腸組織改變，應(yīng)用免疫組化的方法觀察各組大鼠腸組織中Claudin-1及TLR4的表達(dá)情況。結(jié)果:美沙拉嗪組TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率低于模型組,而Claudin-1表達(dá)則高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。聯(lián)合治療組Claudin-1及TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率與美沙拉嗪組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對(duì)照組相比,差異有意義(P< 0.05)。結(jié)論：美沙拉嗪聯(lián)合益生菌有抑制TLR4的表達(dá)和促進(jìn)Claudin-1表達(dá)的作用,較單獨(dú)應(yīng)用美沙拉嗪效果更佳。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；益生菌；Claudin-1；TLR4

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)是一種病因尚不明確的主要限于結(jié)腸黏膜與黏膜下層的非特異性炎癥性腸病，呈連續(xù)性彌漫性分布。主要表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的腹瀉、黏液膿血便及腹痛癥狀，病程呈慢性經(jīng)過(guò)，發(fā)作與緩解交替，少數(shù)癥狀持續(xù)并逐漸加重。以往西方等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率相對(duì)較高，但隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展及飲食結(jié)構(gòu)的變化，近年來(lái)該病發(fā)病率也在日益增高[1]。TLR4 /NF-kB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是目前發(fā)現(xiàn)的重要的炎性通路之一,TLR4 /NF-kB信號(hào)通路主要經(jīng)過(guò)髓樣分化因子 88 (myeloid differeniationfactor 88, MyD88)依賴(lài)的信號(hào)通路及MyD88非依賴(lài)的信號(hào)通路激活NF-kB, 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中,激活炎癥因子引起炎癥反應(yīng)[2]。claudins蛋白為腸黏膜上皮細(xì)胞緊密連接的重要組成部分，對(duì)維持腸黏膜屏障機(jī)械結(jié)構(gòu)完整和正常功能發(fā)揮起重要作用。Claudin-1屬于緊密連接蛋白 claudins家族，是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白之一，Claudin-1蛋白的表達(dá)異常可引起黏膜屏障功能紊亂，導(dǎo)致緊密連接功能失調(diào)和組織滲透性的增加[3]。有專(zhuān)家發(fā)現(xiàn) UC患者腸道中有益菌群和有害菌群比例嚴(yán)重失衡，菌群紊亂在 UC的發(fā)病過(guò)程扮演重要角色[4]，近年來(lái)，益生菌在UC的治療中越來(lái)越受到視，但其機(jī)制尚不明確，本研究通過(guò)應(yīng)用美常安聯(lián)合美沙拉嗪治療DSS誘導(dǎo)UC大鼠模型，通過(guò)檢測(cè)Claudin-1及TLR4在結(jié)腸黏膜上的表達(dá)以探討其可能的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用益生菌治療UC提供幫助。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)6～8周齡，雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量200～230g，由佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分為對(duì)照組、模型組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組。

1.2材料和儀器

葡聚糖硫酸鈉DSS(Sigma公司),美沙拉嗪腸溶片(佳木斯鹿靈制藥公司),枯草桿菌二聯(lián)活菌腸溶膠囊(美常安)(北京韓美公司), Claudin-1、TLR4抗兔抗體(武漢博士德公司)。

1.3方法1.3.1動(dòng)物模型制備

SD大鼠適應(yīng)環(huán)境一周后，隨機(jī)抽取8只作為空白對(duì)照組，給予自由飲水，對(duì)其余大鼠參照Cooper等[5]的方法自由飲用5%的葡聚糖硫酸鈉溶液(DSS)7d，以制備潰瘍性結(jié)腸炎模型，造模后對(duì)照組及模型組給予等滲生理鹽水1mL/d灌胃，美沙拉嗪組給予美沙拉嗪0.4g·kg-1·d-1溶于2mL生理鹽水中灌胃,聯(lián)合治療組給予美沙拉嗪0.4g·kg-1·d-1溶于2mL生理鹽水及美常安0.15g·kg-1·d-1溶于2mL生理鹽水中灌胃,觀察大鼠精神狀態(tài)，飲食、大便情況，體重變化。用藥7d后，禁食24h，麻醉處死大鼠，剃毛，75%酒精浸泡5min，剖腹，分離結(jié)腸，取結(jié)腸病變組織將其連續(xù)切成1cm長(zhǎng)度的腸段，置于4%多聚甲醛進(jìn)行組織固定，后組織塊常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片(4μm)，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2Claudin-1及TLR4免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)腸組織內(nèi)Claudin-1及TLR4，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。采用圖像分析軟件進(jìn)行免疫組織化學(xué)圖片分析,并對(duì)OD值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各組資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般狀態(tài)

對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)佳，常嬉戲打鬧，進(jìn)食如常，毛發(fā)順滑、光澤，排便正常，體重增加。模型組大鼠精神萎靡、進(jìn)食量減少，毛發(fā)暗淡無(wú)光澤、伴有稀便、血便，體重較前下降，美沙拉嗪組大鼠隨用藥時(shí)間的增加精神狀態(tài)較前恢復(fù)，毛發(fā)欠光澤，活動(dòng)及進(jìn)食增加，未見(jiàn)血便，體重稍有增加。聯(lián)合治療組大鼠癥狀好轉(zhuǎn)，未見(jiàn)血便。

2.2肉眼觀察

對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜光滑，未見(jiàn)充血、水腫。模型組大鼠結(jié)腸炎癥病變部位腸管增粗,腸道與周?chē)M織黏連明顯，多發(fā)潰瘍，充血水腫現(xiàn)象嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)腹水。美沙拉嗪組病變部位腸黏膜存在充血、水腫、糜爛及潰瘍形成,但較模型組明顯好轉(zhuǎn)。聯(lián)合治療組腸道病變減輕，部分存在充血、水腫，糜爛、淺潰瘍。

2.3HE染色

對(duì)照組大鼠結(jié)腸黏膜完整，腺體排列整齊、杯狀細(xì)胞無(wú)減少。

圖1模型組大鼠結(jié)腸病變主要累及黏膜層及黏膜下層，可見(jiàn)腺體大量破壞，排列極其紊亂，杯狀細(xì)胞減少，大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大量纖維素樣滲出(HE×100)。

圖2美沙拉嗪組可見(jiàn)黏膜下層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，腺體排列不齊，少量纖維素樣滲出(HE×100)。

圖3聯(lián)合治療組可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜層及黏膜下層仍存有腺體破壞，黏膜下層可見(jiàn)肉芽組織增生(HE×100)。

2.4免疫組織化學(xué)染色

Claudin-1主要存在于腸上皮緊密連接的細(xì)胞膜上，為棕黃色染色顆粒。對(duì)照組大鼠腸道黏膜內(nèi)可見(jiàn)棕黃色顆粒沉著，模型組大鼠腸道黏膜內(nèi)很少見(jiàn)到棕黃色顆粒沉著，美沙拉嗪組可見(jiàn)到棕黃色顆粒沉著，但相對(duì)正常組較少，聯(lián)合治療組可見(jiàn)較多棕黃色顆粒沉著。

TLR4在各組腸道黏膜內(nèi)均有表達(dá)。對(duì)照組大鼠腸道粘膜層內(nèi)可見(jiàn)少許棕色顆粒沉著，與對(duì)照組比較，模型組大鼠腺體消失，可見(jiàn)多處棕色顆粒沉著，美沙拉嗪組黏膜里棕色顆粒沉著較多，但比模型組少。聯(lián)合治療組黏膜內(nèi)棕色顆?？梢?jiàn)，但相對(duì)較少，黏膜炎癥較前減輕。

美沙拉嗪組TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率低于模型組,而Claudin-1表達(dá)則高于模型組，差異有顯著性(P<0.05)。聯(lián)合治療組Claudin-1及TLR4的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率與美沙拉嗪組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),與對(duì)照組相比,差異有意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1　結(jié)腸組織免疫組化Claudin-1及TLR4的OD值

注：與對(duì)照組比較*P<0.05,與模型組比較#P<0.05,與美沙拉嗪組比較&P<0.05,n為各組大鼠數(shù)量，其中模型組大鼠死亡一只。

3討論

UC的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與遺傳、環(huán)境及免疫失調(diào)等因素有關(guān)。近年來(lái)研究表明腸道黏膜免疫系統(tǒng)紊亂及黏膜屏障破壞均參與UC的病情發(fā)展。TLR4為T(mén)oll樣受體家族中的成員，其在正常結(jié)腸上皮細(xì)胞中呈低表達(dá)，從而降低對(duì)腸道中細(xì)菌脂多糖的識(shí)別，而在UC的結(jié)腸中呈高表達(dá)，對(duì)細(xì)菌脂多糖呈現(xiàn)異常識(shí)別[6]，后經(jīng)下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終使NF-kB轉(zhuǎn)入核內(nèi)，釋放促炎癥因子，介導(dǎo)腸道黏膜的天然免疫反應(yīng)，進(jìn)而擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。譚芳等研究表明TLR4mAb抑制了大鼠UC模型TLR4 信號(hào)通路下游級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)TLR4的正反饋?zhàn)饔?，阻止了惡性循環(huán)，使TLR4及炎癥因子的表達(dá)下降，有助于控制腸道炎癥[7]。姜威等研究也表明TNBS誘導(dǎo)大鼠UC模型結(jié)腸組織的TLR2、TLR4、NF-kB mRNA和蛋白水平較對(duì)照組明顯升高[8]。腸道黏膜屏障可以抵御內(nèi)、外源性微生物侵入體內(nèi)，其中機(jī)械屏障起重要作用，claudins蛋白為腸道上皮結(jié)構(gòu)重要組成部分，腸道上皮結(jié)構(gòu)的完整可以維持腸上皮細(xì)胞極性和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障的完整性,阻止有害物質(zhì)侵入機(jī)體。Claudin-1為claudins蛋白家族中的一種，其在正常腸道黏膜中呈均勻分布，而在UC中表達(dá)則不同程度減少。研究發(fā)現(xiàn)在炎性反應(yīng)性腸病活動(dòng)期結(jié)腸黏膜固有層中，Claudin-1及其mRNA表達(dá)顯著降低，腸上皮通透性增加[3]。近年來(lái)人們對(duì)UC腸道內(nèi)環(huán)境的研究越來(lái)越受到重視，有研究表明UC患者腸道菌群紊亂，有益菌減少而有害菌群比例上升，因此益生菌作為一種新的治療UC的方法越來(lái)越多的被學(xué)者們進(jìn)行研究。雖然沒(méi)有確定具體的細(xì)菌與IBD的關(guān)系 ，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，破壞道細(xì)菌和宿主防御機(jī)制中的黏膜(生態(tài)失調(diào))的動(dòng)態(tài)平衡可能觸發(fā)這種炎癥反應(yīng)。慢性炎癥可導(dǎo)致細(xì)菌成分的滲透引起腸道屏障損傷[9]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)應(yīng)用美沙拉嗪聯(lián)合益生菌治療DSS誘導(dǎo)UC大鼠模型，可有效減少大鼠排便次數(shù)，腸道黏膜充血、水腫癥狀較模型組減輕，腸道組織TLR4表達(dá)較對(duì)照組表達(dá)升高，Claudin-1表達(dá)較對(duì)照組減少但較單獨(dú)應(yīng)用美沙拉嗪有所增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮腸道黏膜屏障功能有所恢復(fù)，而聯(lián)合用藥治療效果更明顯。美常安可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)及修復(fù)腸道黏膜屏障來(lái)治療UC，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究及探討。

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基金項(xiàng)目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目,編號(hào)：LM2015_019。

作者簡(jiǎn)介：許海英(1990～)女，黑龍江大慶人，在讀碩士研究生。 通訊作者：顏玉(1963～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：jmsyanyu1963@163.com。

中圖分類(lèi)號(hào)：R574.62

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0052-03

(收稿日期：2016-02-29)