侯艷妮，李義強(qiáng)，周　昱，王　博，胡少軍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

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LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌浸潤(rùn)過(guò)程中的表達(dá)及與血管生成的關(guān)系①

侯艷妮，李義強(qiáng)，周昱，王博，胡少軍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

摘要：目的：通過(guò)對(duì)LGR5、Nodal蛋白在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤(rùn)癌中表達(dá)水平的研究，探討LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，并且通過(guò)研究LGR5、Nodal蛋白與血管生成相關(guān)因子CD34在乳腺浸潤(rùn)癌中的關(guān)系，進(jìn)一步探討兩因子在乳腺癌血管生成事件中的作用。方法：應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)LGR5、Nodal蛋白在30例正常乳腺組織、24例乳腺原位癌、66例浸潤(rùn)癌中的表達(dá)水平，并且檢測(cè)在66例乳腺浸潤(rùn)癌中LGR5、Nodal蛋白與CD34的表達(dá)水平，分析LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)展過(guò)程中的作用以及與乳腺癌血管生成之間的關(guān)系。結(jié)果：LGR5、Nodal在乳腺癌中呈高表達(dá)，明顯高于原位癌、正常乳腺組織組(P<0.01)。LGR5、Nodal的表達(dá)水平均與患者年齡無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)；與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)(P<0.01)；LGR5、Nodal分別與CD34、MVD之間存在相關(guān)性(P<0.01)，且陽(yáng)性發(fā)生率一致，說(shuō)明LGR5、Nodal蛋白均與乳腺癌血管生成呈正相關(guān)。結(jié)論：LGR5、Nodal在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且可能促進(jìn)了乳腺癌血管的生成。另外，在乳腺癌中LGR5、Nodal之間存在正相關(guān)系。

關(guān)鍵詞：乳腺癌；LGR5；Nodal；CD34；血管生成

眾所周知，乳腺癌是影響女性身心健康甚則 危及生命的最常見(jiàn)的癌癥。因此，研究乳腺癌的各種致病因素、發(fā)病機(jī)制以及可能的治療靶點(diǎn)已經(jīng)成為當(dāng)代學(xué)者迫不及待需要解決的問(wèn)題。LGR5是最新發(fā)現(xiàn)的一種7 次跨膜 G蛋白偶聯(lián)受體，在人體的多種組織中如脊髓、大腦、眼睛、胃腸道及生殖器官等多處都有表達(dá)，是多種組織成體干細(xì)胞的標(biāo)志物。研究證明，LGR5可作為腸等部位的干細(xì)胞標(biāo)志物，且其表達(dá)的產(chǎn)物在胚胎和器官的發(fā)育以及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中均發(fā)揮著重要作用。并且，LGR5在卵巢癌、結(jié)腸癌、基底細(xì)胞癌以及肝癌中表達(dá)均升高[1]。Nodal蛋白是胚胎形成素的一種，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，既可以調(diào)控胚胎干細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的可塑性及惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲，維持胚胎干細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞的分化多潛能性[2]。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性黑素瘤、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌都可檢測(cè)到Nodal蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)這些腫瘤的發(fā)生，發(fā)展轉(zhuǎn)移及預(yù)后中離不開(kāi)Nodal蛋白的影響[3]，表明Nodal蛋白可能是腫瘤進(jìn)展中，腫瘤從可控階段發(fā)展到更具侵襲性及轉(zhuǎn)移性階段一個(gè)重要的標(biāo)志物。但是，國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有關(guān)于LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的研究報(bào)道，因此，我們通過(guò)研究LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)情況，并且通過(guò)分析LGR5、Nodal蛋白與血管生成指標(biāo)CD34之間的相關(guān)性，初步探討LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能性作用，為臨床研究提供更多的試驗(yàn)證據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料和方法

1.1一般資料

收集2014-05～2015-05佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科乳腺疾病手術(shù)切除標(biāo)本，其中乳腺正常組織30例、原位癌24例、浸潤(rùn)癌66例。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)所有患者均為女性；2)所有患者術(shù)前均未經(jīng)過(guò)放化療、生物治療及中西醫(yī)結(jié)合治療；3)所有標(biāo)本均經(jīng)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科資深病理醫(yī)生進(jìn)行讀片確定診斷。

1.2 試驗(yàn)

1.2.1試驗(yàn)方法

采用免疫組化法：三組組織標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋存檔，標(biāo)本做3μm厚度連續(xù)切片及HE染色。采用SP法檢測(cè)LGR5、Nodal、CD34在不同標(biāo)本中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照實(shí)際說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2結(jié)果判定

陽(yáng)性結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核呈黃色者判為陽(yáng)性。先在低倍鏡下對(duì)組織切片全面觀察，隨后在200倍的光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野。通過(guò)將細(xì)胞的陽(yáng)性的強(qiáng)度評(píng)分和陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分相加來(lái)綜合判斷染色結(jié)果。

微血管密度(MVD)計(jì)數(shù)：先在40倍顯微鏡下觀察病理，選擇出癌灶內(nèi)微血管密度最密集的三個(gè)區(qū)域，然后再在200倍鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)區(qū)域中的MVD，取三個(gè)區(qū)域的平均值作為該張腫瘤切片的微血管密度。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等級(jí)資料進(jìn)行秩和檢驗(yàn)，一般性分類(lèi)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩變量間相關(guān)性采用 Spearman 相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤(rùn)癌中的表達(dá)

LGR5陽(yáng)性染色表現(xiàn)為均勻細(xì)小黃色顆粒，主要分布于細(xì)胞質(zhì)，其在乳腺正常組織、原位癌、浸潤(rùn)癌中陽(yáng)性率分別為：13.33%(4/30)、54.17% (13/24)、89.39% (59/66)。Nodal蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)同樣主要表現(xiàn)在乳腺病變組織的細(xì)胞質(zhì)中，其在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤(rùn)癌中的陽(yáng)性表達(dá)率為6.67%(2/30)、58.33%(14/24)、80.30%(53/66)。兩組因子在乳腺癌中表達(dá)明顯高于乳腺正常組織組及原位癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表1。

2.2LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系

我們進(jìn)一步分析了LGR5、Nodal與血管生成相關(guān)蛋白CD34表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，LGR5、Nodal、CD34表達(dá)水平與腫瘤大小、組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著相關(guān)(P<0.05)；與年齡無(wú)顯著相關(guān)(P值分別為：0.267、0.629、0.916)。見(jiàn)表2。

表1　LGR5、Nodal蛋白、CD34在乳腺正常組織、乳腺原位癌、浸潤(rùn)癌中的表達(dá)

表2　LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及與臨床病理的關(guān)系

注明：1.#表示采用秩和卡方檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算；2.*表示采用Fisher 精確概率卡方檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算。

2.3LGR5、Nodal蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)與MVD之間的關(guān)系

乳腺癌組織標(biāo)本LGR5、Nodal蛋白和 CD34免疫組化染色情況提示：LGR5、Nodal蛋白陽(yáng)性表達(dá)均多位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)；微血管密度采取癌組織CD34免疫組化染色方式檢測(cè)，染色也主要位于細(xì)胞質(zhì)。 同時(shí)，對(duì)乳腺癌組織中LGR5、Nodal蛋白、MVD表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果提示，LGR5陽(yáng)性表達(dá)與CD34陽(yáng)性表達(dá)間存在顯著相關(guān)(P<0.01)；Nodal蛋白陽(yáng)性表達(dá)與CD34陽(yáng)性表達(dá)之間也存在顯著相關(guān)(P<0.01)，且LGR5與Nodal之間亦有顯著相關(guān)(P<0.01)。見(jiàn)表3～5。

表3　Lgr5、CD34and MVD 在乳腺癌組織中

表4　Nodal、CD34 and MVD 在乳腺癌組織中

表5　Lgr5、Nodal在乳腺癌組織中表達(dá)相關(guān)性分析

3討論

乳腺癌是一種內(nèi)分泌依賴性腫瘤,除ER、PR外,包括LGR5、Nodal在內(nèi)的多種因子均可能參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。因此,闡明LGR5、Nodal等在乳腺癌發(fā)生中的作用及相關(guān)機(jī)制對(duì)于乳腺癌的內(nèi)分泌治療研究非常必要。近年來(lái),大量實(shí)驗(yàn)研究表明LGR5、Nodal均可以參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)腫瘤血管生成，但其各自在乳腺癌中的表達(dá)尚沒(méi)有見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

我們首先分別檢測(cè)了LGR5、Nodal在乳腺正常組織、乳腺原位癌、乳腺癌及浸潤(rùn)癌組織中的表達(dá)。相比于在正常組織及乳腺原位癌，LGR5、Nodal在浸潤(rùn)癌組織中呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。這同我們預(yù)計(jì)結(jié)果相同。我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)在乳腺癌組織中,LGR5、Nodal的高表達(dá)與乳腺癌的腫瘤大小、分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成正相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)需要新的微血管生成,而新的血管生成提供了腫瘤的血液營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),也增加了惡性腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)率,故微血管密度在許多原發(fā)腫瘤中已被作為判斷生物學(xué)侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能的指標(biāo)。而生成血管的血管內(nèi)皮細(xì)胞染色可以清楚地顯示腫瘤的血管密度, 反映腫瘤的生物學(xué)特性。CD34作為一種血管內(nèi)皮染色劑，靈敏度高，干擾小，清晰度好[4]，所以我們又在浸潤(rùn)癌中檢測(cè)了血管生成相關(guān)因子CD34的表達(dá)情況，并且在高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)微血管密度，分別統(tǒng)計(jì)分析LGR5、Nodal與CD34、MVD之間的相關(guān)性，結(jié)果示：LGR5、Nodal與CD34、MVD之間均呈正相關(guān)，并且LGR5、Nodal之間也為正相關(guān)，這就說(shuō)明了LGR5、Nodal可能促進(jìn)了乳腺癌的血管生成。總結(jié)來(lái)說(shuō),LGR5、Nodal在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，可能通過(guò)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、血管生成、轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生進(jìn)展。但由于實(shí)驗(yàn)樣本過(guò)少，而且國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有此方面的文獻(xiàn)報(bào)道，所以LGR5、Nodal在乳腺癌中的具體作用有待進(jìn)一步的研究證明。

目前，學(xué)者們還未發(fā)現(xiàn)乳腺干細(xì)胞確切的標(biāo)志物[5]，部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳腺干細(xì)胞定位于末端導(dǎo)管小葉單位；而另有研究人員研究則顯示乳腺干細(xì)胞位于基底上皮層。LGR5、Nodal能否作為乳腺干細(xì)胞標(biāo)志物還需進(jìn)一步研究來(lái)證實(shí)。也有人稱LGR5是橫跨胚層的干細(xì)胞標(biāo)志物，或許能代表成體干細(xì)胞的普遍標(biāo)志物，但這個(gè)結(jié)論尚有待更多研究證實(shí)。而β超家族成員Nodal蛋白僅表達(dá)于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞、胚胎組織以及腫瘤細(xì)胞中，目前已發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞株中存在Nodal的表達(dá)，如睪丸癌的移植瘤、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、胃腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌、膀胱腫瘤等。研究發(fā)現(xiàn)Nodal蛋白可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞形成管狀血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)即血管生成擬態(tài)的形成，并且可以誘導(dǎo)VEGF的分泌，從而促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在今后的研究中，我們希望進(jìn)一步探討LGR5、Nodal通過(guò)何種機(jī)制促進(jìn)惡性乳腺癌發(fā)生發(fā)展以及血管生成，明確兩因子在促進(jìn)乳腺癌生成中是否為必要條件，從而為乳腺癌的臨床工作提供更有力的證據(jù)。

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基金項(xiàng)目：①佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào)：LM2015_032

作者簡(jiǎn)介：侯艷妮(1987～)女，陜西寶雞人，在讀碩士研究生。 通訊作者：李義強(qiáng)(1961～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：471742477@qq.com。

中圖分類(lèi)號(hào)：R737.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0104(2016)04-0031-03

(收稿日期：2015-09-24)