劉　丹　趙玉霞　于　洪　屈艷麗　高　雅　陳　穎

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科，遼寧　沈陽　110032)

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DNA連接酶4及熱休克蛋白B1基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的相關性

劉丹趙玉霞于洪1屈艷麗1高雅陳穎

(中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科，遼寧沈陽110032)

〔摘要〕目的探討DNA連接酶4(LIG4)和熱休克蛋白B1(HSPB1)基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關系。方法采用病例-對照研究和Taqman real-time PCR對193例鼻咽癌患者和211例健康對照組外周血DNA進行單核苷酸多態(tài)性的基因分型。結(jié)果LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌組和健康對照組之間無明顯差異(P>0.05)。單因素及多因素分析顯示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位點多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)生風險無關。結(jié)論LIG4rs1805388和HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性無關。

〔關鍵詞〕鼻咽癌；DNA連接酶4；熱休克蛋白B1；單核苷酸多態(tài)性；易感性

鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的地域和種族差異，存在家族高發(fā)傾向，在中國南方和東南亞國家或地區(qū)高發(fā)。目前認為鼻咽癌是一種多基因遺傳病，發(fā)病過程中涉及多個基因之間或基因與環(huán)境之間的交互作用〔1〕。DNA連接酶(LIG)4是DNA雙鏈斷裂(DSB)非同源末端鏈接(NHEJ)修復通路中一個重要的修復因子〔2,3〕。熱休克蛋白(HSP)B1在腫瘤基因表達、DNA修復、蛋白分子伴侶、免疫應答、信號轉(zhuǎn)導以及細胞分化、增殖、細胞衰老或細胞無限繁殖中起著重要的作用〔4〕。LIG4和HSPB1的基因單核苷酸多態(tài)性與膠質(zhì)瘤、肺癌等多種腫瘤的易感性相關，目前尚未見兩者與鼻咽癌易感性的研究。本研究探討LIG4和HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與鼻咽癌易感性的關系。

1材料與方法

1.1研究對象病例組來自2010年9月至2012年3月中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院和遼寧省腫瘤醫(yī)院，有明確的病理診斷原發(fā)性鼻咽癌患者193例。211例健康對照組來自上述醫(yī)院同期就診的非腫瘤患者，按性別、年齡(±3歲)、吸煙狀況與病例頻數(shù)匹配。均為漢族，患者之間、對照之間、患者與對照之間彼此均無親緣關系。在簽署知情同意書后，提供外周血標本，同時完成流行病學調(diào)查。病例組193例，男132例，女61例，年齡13～78(中位52)歲，吸煙者76例，15例無法知道吸煙否。健康對照組211例，男146例，女65例，年齡17～78(中位52)歲，吸煙者65例，兩組年齡(P=8.08)、性別(P=0.862)無差異，吸煙者比例有差異(P=0.15)。

1.2調(diào)查方法及外周血采集采用統(tǒng)一制定的調(diào)查表，由兩名培訓的調(diào)查員對病例及對照組進行流行病學調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括每個研究對象詳細的人口學資料、發(fā)病年齡、吸煙史、家族患癌史、職業(yè)史、手術史、放化療史，病變位置、腫瘤大小、組織類型、臨床表現(xiàn)、伴發(fā)疾病以及飲食等生活習慣。非吸煙者定義為終生吸煙少于100支的個體。所有調(diào)查資料經(jīng)反復檢查、核對和編碼后，用Excel軟件進行數(shù)據(jù)錄入。所有參與研究的個體外周血標本采集使用枸櫞酸鈉抗凝試管，每人采血2 ml，在-20℃或-80℃的冰箱中凍存。

1.3實驗方法集中進行基因組DNA提取，采用酚-氯仿法，提取后測OD值確定DNA的原始濃度，再倍比稀釋到30～100 ng/μl的終濃度備用。采用Taqman real-time PCR方法進行單核苷酸多態(tài)性的基因分型?；蚍中驮贏BI 7500熒光定量PCR儀上進行，擴增條件為：95℃預變性10 min；92℃變性30 s，60℃退火以及延伸1 min；共47個循環(huán)。以SDS(美國應用生物系統(tǒng)公司)軟件Allelic Discrimination程序進行終點分析，通過檢測不同等位基因所標記的FAM和VIC熒光強度，判斷待測樣本的基因型。

1.4質(zhì)量控制流行病學調(diào)查質(zhì)量控制：所有調(diào)查員都接受為期一周的標準化培訓；使用統(tǒng)一的簡明易懂的調(diào)查表；流行病學學科專家監(jiān)督指導；隨機抽取10%的樣本二重調(diào)查，并與原始記錄核對；隨機抽取10%的病歷，檢查其完整性和準確性；編制編碼手冊，以檢驗調(diào)查表編碼情況并評價數(shù)據(jù)錄入工作；記錄調(diào)查過程中遇到的所有問題；為減少誤差，對病例和對照的調(diào)查工作在報告后2個月內(nèi)完成；編制包含詳細的收集、分析、保存和運輸?shù)葍?nèi)容的手冊。實驗室質(zhì)量控制：在每個96孔檢測單元中分別設立陰性對照和重復標本作為質(zhì)量控制；陰性對照中不加模板DNA，而以雙蒸水代替，用于檢驗是否存在PCR污染。每個SNP的信號強度需在兩個尺度上滿足形成三個明顯的簇，由ABI的SDS軟件完成。進行基因分型時實驗者對于標本的病例對照狀態(tài)未知。隨機選擇10%的樣本進行盲法重復測量。

1.5統(tǒng)計學分析利用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，以χ2檢驗檢查比較人口學特征、相關危險因素暴露及SNPs基因型在病例與對照之間分布的差異；以擬合優(yōu)度χ2檢驗檢查對照的Hardy-Weinberg分布平衡情況；以單因素和多因素Logistic回歸計算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對危險度。

2結(jié)果

檢測的2個SNPs的基因型在健康對照組的分布頻率經(jīng)χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌組和健康對照組之間無明顯差異(P>0.05)。單因素分析及納入年齡、性別及吸煙狀態(tài)多因素分析顯示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位點多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)生風險無關。見表1。

表1　各基因型與鼻咽癌易感性的相關性〔n(%)〕

1)單因素分析結(jié)果；2)多因素分析結(jié)果；3)有數(shù)據(jù)缺失

3討論

哺乳動物細胞中DNA雙鏈斷裂后最主要通過激活NHEJ通路修復斷裂的DNA雙鏈。哺乳動物細胞中參與NHEJ機制的核心組分包括DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)、X射線修復交叉互補蛋白4(XRCC4)、Ku70(XRCC6),Ku80(XRCC5)，DNA連接酶Ⅳ〔5〕。DNA雙鏈斷裂修復能力與癌癥易感性相關，當NHEJ修復通路中的基因突變或缺失，則導致DNA損傷修復能力降低致腫瘤的發(fā)生。Liu等〔6〕發(fā)現(xiàn)LIG4rs3093739位點的C基因增加膠質(zhì)瘤的患病風險，而LIG4rs1805388位點基因多態(tài)性與膠質(zhì)瘤的患病風險無關。Zhao等〔7〕對400余例膠質(zhì)瘤的病例對照研究發(fā)現(xiàn)LIG4rs1805388位點的T基因增加膠質(zhì)瘤的患病風險(OR=3.27)。Li等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)LIG4 rs 1805388位點的C基因增加有糖尿病史人群患胰腺癌的風險。英國的一項研究顯示〔9〕LIG4(T>C nt 1977)的C等位基因可降低乳腺癌發(fā)病風險(OR=0.7)。目前未見LIG4rs1805388基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性的報道。本實驗首次研究了LIG4rs1805388位點基因多態(tài)性與遼寧漢族人群鼻咽癌發(fā)病風險的關系。本研究結(jié)果顯示:LIG4rs1805388位點存在CC、CT和TT三種基因型,其中健康對照組的CC型為64.9%，CT為30.8%，TT為4.3%,這與國內(nèi)Liu等〔6〕的報道一致。鼻咽癌患者組的CC型為70.8%，CT為23.4%，TT為5.7%，鼻咽癌患者組與正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

HSPB1參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后。郭云鴻等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)HSP27在宮頸癌組織高表達，與病理分級密切相關，提示HSP27可能參與了宮頸鱗癌的早期發(fā)生。研究顯示HSP27 在肺癌組織中有廣泛表達，在臨床有轉(zhuǎn)移和病理細胞分化低的組織中表達增高〔11〕。Guo等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)HSPB1-1271G>C多態(tài)性與肺癌易感性相關，GC基因型能顯著增加肺癌發(fā)病風險。目前未見HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌的易感性的報道。本研究認為HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌的易感性的無關。

綜上，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性無關。目前,基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)病風險的關系不是很明確,來自不同民族、不同地區(qū)的研究對象可能得到不同、甚至矛盾的結(jié)果,這可能與遺傳因素的地域性和種族性有關,還有可能是與樣本含量較小有關，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371位點純合突變率均較低，小樣本結(jié)果不能達到應有的統(tǒng)計效能。所以LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病風險的關系還有待于進一步研究。

4參考文獻

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〔2014-05-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

基金項目：遼寧省科技廳科學計劃項目(No.2011225019)；沈陽市社會發(fā)展科技攻關項目(No.F12-193-9-40)

通訊作者：趙玉霞(1962-)，女，教授，博士生導師，主要從事肺癌、鼻咽癌和放射性損傷的研究。

〔中圖分類號〕R739.6

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2951-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.060

1遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療三科

第一作者：劉丹(1979-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事肺癌及放射性肺損傷的基礎和臨床研究。