劉　丹　趙玉霞　于　洪　屈艷麗　高　雅　陳　穎

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科，遼寧　沈陽(yáng)　110032)

?

DNA連接酶4及熱休克蛋白B1基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的相關(guān)性

劉丹趙玉霞于洪1屈艷麗1高雅陳穎

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科，遼寧沈陽(yáng)110032)

〔摘要〕目的探討DNA連接酶4(LIG4)和熱休克蛋白B1(HSPB1)基因單核苷酸多態(tài)性與鼻咽癌易感性的關(guān)系。方法采用病例-對(duì)照研究和Taqman real-time PCR對(duì)193例鼻咽癌患者和211例健康對(duì)照組外周血DNA進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的基因分型。結(jié)果LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌組和健康對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。單因素及多因素分析顯示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位點(diǎn)多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。結(jié)論LIG4rs1805388和HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性無(wú)關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕鼻咽癌；DNA連接酶4；熱休克蛋白B1；單核苷酸多態(tài)性；易感性

鼻咽癌的發(fā)病具有明顯的地域和種族差異，存在家族高發(fā)傾向，在中國(guó)南方和東南亞國(guó)家或地區(qū)高發(fā)。目前認(rèn)為鼻咽癌是一種多基因遺傳病，發(fā)病過(guò)程中涉及多個(gè)基因之間或基因與環(huán)境之間的交互作用〔1〕。DNA連接酶(LIG)4是DNA雙鏈斷裂(DSB)非同源末端鏈接(NHEJ)修復(fù)通路中一個(gè)重要的修復(fù)因子〔2,3〕。熱休克蛋白(HSP)B1在腫瘤基因表達(dá)、DNA修復(fù)、蛋白分子伴侶、免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞衰老或細(xì)胞無(wú)限繁殖中起著重要的作用〔4〕。LIG4和HSPB1的基因單核苷酸多態(tài)性與膠質(zhì)瘤、肺癌等多種腫瘤的易感性相關(guān)，目前尚未見(jiàn)兩者與鼻咽癌易感性的研究。本研究探討LIG4和HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與鼻咽癌易感性的關(guān)系。

1材料與方法

1.1研究對(duì)象病例組來(lái)自2010年9月至2012年3月中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院和遼寧省腫瘤醫(yī)院，有明確的病理診斷原發(fā)性鼻咽癌患者193例。211例健康對(duì)照組來(lái)自上述醫(yī)院同期就診的非腫瘤患者，按性別、年齡(±3歲)、吸煙狀況與病例頻數(shù)匹配。均為漢族，患者之間、對(duì)照之間、患者與對(duì)照之間彼此均無(wú)親緣關(guān)系。在簽署知情同意書(shū)后，提供外周血標(biāo)本，同時(shí)完成流行病學(xué)調(diào)查。病例組193例，男132例，女61例，年齡13～78(中位52)歲，吸煙者76例，15例無(wú)法知道吸煙否。健康對(duì)照組211例，男146例，女65例，年齡17～78(中位52)歲，吸煙者65例，兩組年齡(P=8.08)、性別(P=0.862)無(wú)差異，吸煙者比例有差異(P=0.15)。

1.2調(diào)查方法及外周血采集采用統(tǒng)一制定的調(diào)查表，由兩名培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)病例及對(duì)照組進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括每個(gè)研究對(duì)象詳細(xì)的人口學(xué)資料、發(fā)病年齡、吸煙史、家族患癌史、職業(yè)史、手術(shù)史、放化療史，病變位置、腫瘤大小、組織類型、臨床表現(xiàn)、伴發(fā)疾病以及飲食等生活習(xí)慣。非吸煙者定義為終生吸煙少于100支的個(gè)體。所有調(diào)查資料經(jīng)反復(fù)檢查、核對(duì)和編碼后，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。所有參與研究的個(gè)體外周血標(biāo)本采集使用枸櫞酸鈉抗凝試管，每人采血2 ml，在-20℃或-80℃的冰箱中凍存。

1.3實(shí)驗(yàn)方法集中進(jìn)行基因組DNA提取，采用酚-氯仿法，提取后測(cè)OD值確定DNA的原始濃度，再倍比稀釋到30～100 ng/μl的終濃度備用。采用Taqman real-time PCR方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的基因分型?；蚍中驮贏BI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性10 min；92℃變性30 s，60℃退火以及延伸1 min；共47個(gè)循環(huán)。以SDS(美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)軟件Allelic Discrimination程序進(jìn)行終點(diǎn)分析，通過(guò)檢測(cè)不同等位基因所標(biāo)記的FAM和VIC熒光強(qiáng)度，判斷待測(cè)樣本的基因型。

1.4質(zhì)量控制流行病學(xué)調(diào)查質(zhì)量控制：所有調(diào)查員都接受為期一周的標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)；使用統(tǒng)一的簡(jiǎn)明易懂的調(diào)查表；流行病學(xué)學(xué)科專家監(jiān)督指導(dǎo)；隨機(jī)抽取10%的樣本二重調(diào)查，并與原始記錄核對(duì)；隨機(jī)抽取10%的病歷，檢查其完整性和準(zhǔn)確性；編制編碼手冊(cè)，以檢驗(yàn)調(diào)查表編碼情況并評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)錄入工作；記錄調(diào)查過(guò)程中遇到的所有問(wèn)題；為減少誤差，對(duì)病例和對(duì)照的調(diào)查工作在報(bào)告后2個(gè)月內(nèi)完成；編制包含詳細(xì)的收集、分析、保存和運(yùn)輸?shù)葍?nèi)容的手冊(cè)。實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制：在每個(gè)96孔檢測(cè)單元中分別設(shè)立陰性對(duì)照和重復(fù)標(biāo)本作為質(zhì)量控制；陰性對(duì)照中不加模板DNA，而以雙蒸水代替，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染。每個(gè)SNP的信號(hào)強(qiáng)度需在兩個(gè)尺度上滿足形成三個(gè)明顯的簇，由ABI的SDS軟件完成。進(jìn)行基因分型時(shí)實(shí)驗(yàn)者對(duì)于標(biāo)本的病例對(duì)照狀態(tài)未知。隨機(jī)選擇10%的樣本進(jìn)行盲法重復(fù)測(cè)量。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以χ2檢驗(yàn)檢查比較人口學(xué)特征、相關(guān)危險(xiǎn)因素暴露及SNPs基因型在病例與對(duì)照之間分布的差異；以擬合優(yōu)度χ2檢驗(yàn)檢查對(duì)照的Hardy-Weinberg分布平衡情況；以單因素和多因素Logistic回歸計(jì)算比值比(OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示相對(duì)危險(xiǎn)度。

2結(jié)果

檢測(cè)的2個(gè)SNPs的基因型在健康對(duì)照組的分布頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)的基因型分布在鼻咽癌組和健康對(duì)照組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。單因素分析及納入年齡、性別及吸煙狀態(tài)多因素分析顯示LIG4C/T(rs1805388)和HSPB1C/G(rs2868371)位點(diǎn)多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1。

表1　各基因型與鼻咽癌易感性的相關(guān)性〔n(%)〕

1)單因素分析結(jié)果；2)多因素分析結(jié)果；3)有數(shù)據(jù)缺失

3討論

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂后最主要通過(guò)激活NHEJ通路修復(fù)斷裂的DNA雙鏈。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與NHEJ機(jī)制的核心組分包括DNA依賴性蛋白激酶(DNA-PK)、X射線修復(fù)交叉互補(bǔ)蛋白4(XRCC4)、Ku70(XRCC6),Ku80(XRCC5)，DNA連接酶Ⅳ〔5〕。DNA雙鏈斷裂修復(fù)能力與癌癥易感性相關(guān)，當(dāng)NHEJ修復(fù)通路中的基因突變或缺失，則導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力降低致腫瘤的發(fā)生。Liu等〔6〕發(fā)現(xiàn)LIG4rs3093739位點(diǎn)的C基因增加膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)，而LIG4rs1805388位點(diǎn)基因多態(tài)性與膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。Zhao等〔7〕對(duì)400余例膠質(zhì)瘤的病例對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)LIG4rs1805388位點(diǎn)的T基因增加膠質(zhì)瘤的患病風(fēng)險(xiǎn)(OR=3.27)。Li等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)LIG4 rs 1805388位點(diǎn)的C基因增加有糖尿病史人群患胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)。英國(guó)的一項(xiàng)研究顯示〔9〕LIG4(T>C nt 1977)的C等位基因可降低乳腺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.7)。目前未見(jiàn)LIG4rs1805388基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首次研究了LIG4rs1805388位點(diǎn)基因多態(tài)性與遼寧漢族人群鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。本研究結(jié)果顯示:LIG4rs1805388位點(diǎn)存在CC、CT和TT三種基因型,其中健康對(duì)照組的CC型為64.9%，CT為30.8%，TT為4.3%,這與國(guó)內(nèi)Liu等〔6〕的報(bào)道一致。鼻咽癌患者組的CC型為70.8%，CT為23.4%，TT為5.7%，鼻咽癌患者組與正常對(duì)照組相比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

HSPB1參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。郭云鴻等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)HSP27在宮頸癌組織高表達(dá)，與病理分級(jí)密切相關(guān)，提示HSP27可能參與了宮頸鱗癌的早期發(fā)生。研究顯示HSP27 在肺癌組織中有廣泛表達(dá)，在臨床有轉(zhuǎn)移和病理細(xì)胞分化低的組織中表達(dá)增高〔11〕。Guo等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)HSPB1-1271G>C多態(tài)性與肺癌易感性相關(guān)，GC基因型能顯著增加肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。目前未見(jiàn)HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌的易感性的報(bào)道。本研究認(rèn)為HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌的易感性的無(wú)關(guān)。

綜上，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌易感性無(wú)關(guān)。目前,基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系不是很明確,來(lái)自不同民族、不同地區(qū)的研究對(duì)象可能得到不同、甚至矛盾的結(jié)果,這可能與遺傳因素的地域性和種族性有關(guān),還有可能是與樣本含量較小有關(guān)，LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371位點(diǎn)純合突變率均較低，小樣本結(jié)果不能達(dá)到應(yīng)有的統(tǒng)計(jì)效能。所以LIG4rs1805388和 HSPB1rs2868371基因多態(tài)性與鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

4參考文獻(xiàn)

1殷蔚伯，余子豪，徐國(guó)鎮(zhèn)，等.腫瘤放射治療學(xué)〔M〕.第4版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2008:443-4.

2Ahnesorg P，Smith P，Jackson SP.XLF interacts with the XRCC4-DNA ligaseⅣ complex to promote DNA nonhomologous end-joining〔J〕.Cell，2006；124(4)：301-3.

3Sakata K，Someya M，Matsumoto Y，etal.Ability to repair DNA double-strand breaks related to cancer susceptibility and radiosensitivity〔J〕.Radiat Med，2007；25(9)：433-8.

4Garrido C，Brunet M，Didelot C，etal.Heat shock proteins 27 and 70：anti-apoptotic proteins with tumorigenic properties〔J〕.Cell Cycle，2006；5(22)：2592-601.

5Lieber MR.The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway〔J〕.Ann Rev Biochem，2010；79:181-211.

6Liu YH,Zhou KK,Zhang HS,etal.Polymorphisms of LIG4 and XRCC4 involved in the NHEJ pathway interact to modify risk of Glioma〔J〕.Hum Mutation，2008;29(3):381-9.

7Zhao P，Zou P，Zhao L，etal.Genetic polymorphisms of DNA double-strandbreak repair pathway genes and glioma susceptibility〔J〕.BMC Cancer，2013；13(1)：234.

8Li DH,Suzuki HA,Liu BR,etal.DNA repair gene polymorphisms and risk of pancreatic cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2009;15(2):740-6.

9Bettina Kuschel,Annika Auranen,Simon McBride,etal.Variants in DNA double-strand break repair genes and breast cancer susceptibility〔J〕.Human Mole Genet，2002；11(12):1399-407.

10郭云鴻，周小燕，吳向暉，等.熱休克蛋白27及Bcl-2在宮頸鱗癌中的表達(dá)及意義〔J〕.河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2009；27(1)：14-6.

11趙勇剛，謝偉，馮茂輝，等.熱休克蛋白 27 在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009；19(8)：1192-4.

12Guo H,Bai Y,Xu P,etal.Functional promoter-127G>C variant of HSBP1 predicts lung cancer risk and survival〔J〕.J Clin Oncol，2010；28:1928-35.

〔2014-05-15修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：遼寧省科技廳科學(xué)計(jì)劃項(xiàng)目(No.2011225019)；沈陽(yáng)市社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目(No.F12-193-9-40)

通訊作者：趙玉霞(1962-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事肺癌、鼻咽癌和放射性損傷的研究。

〔中圖分類號(hào)〕R739.6

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)12-2951-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.060

1遼寧省腫瘤醫(yī)院腫瘤放射治療三科

第一作者：劉丹(1979-)，女，主治醫(yī)師，博士，主要從事肺癌及放射性肺損傷的基礎(chǔ)和臨床研究。