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MicroRNA-499b通過亞甲基四氫葉酸還原酶調節(jié)老年慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸水平的機制及意義

王晟龍靜胡金牛鄧炳取占達良譚戰(zhàn)榮

(?？谑械谌嗣襻t(yī)院老年病科，海南?？?71100)

〔摘要〕目的探究MicroRNA(MiR)-499b在老年慢性心力衰竭(CHF)患者中的表達情況及其對血清同型半胱氨酸(Hcy)含量的影響。方法利用老年CHF患者的組織芯片，通過原位雜交檢測MiR-499b mRNA表達水平；利用熒光素酶和Western印跡檢測MiR-499b對其靶基因亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的表達調控；通過檢測血清中的Hcy表達情況，顯示MiR-499b和MTHFR對Hcy逆轉產生的影響；利用熒光素酶和Western印跡實驗檢測MiR-499b對腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達調控，顯示MiR-499b和TNF-α對CHF逆轉產生的影響。結果MiR-499b在老年CHF患者中顯著降低，并且正向調控MTHFR的表達水平；MiR-499b直接靶向調控MTHFR啟動子活性，增高MTHFR的蛋白表達水平，下調Hcy的表達水平，并且發(fā)現(xiàn)MiR-499b能夠靶向調控TNF-α，降低其表達水平，進而CHF炎癥水平，降低心衰發(fā)生率。結論MiR-499b的低表達與血清Hcy的異常表達具有顯著相關性，MiR-499b通過增強MTHFR的表達降低血清Hcy的表達量；MiR-499b能夠降低TNF-α的表達水平，減少CHF的發(fā)生。

〔關鍵詞〕慢性心力衰竭;同型半胱氨酸;MicroRNA;腫瘤壞死因子-α

慢性心力衰竭(CHF)患者中普遍存在蛋白質定性和定量缺乏，這將導致肌肉和內臟蛋白質代謝混亂〔1,2〕。通過檢測血清中的同型半胱氨酸(Hcy)水平可以初步判斷患者體內是否存在蛋白質代謝異常〔3～5〕。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變是導致血漿 Hcy 輕度升高的重要原因〔6〕;CHF患者體內，某些炎癥因子的表達也存在異常升高，如腫瘤壞死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6等〔7〕。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，MicroRNAs可能參與CHF的發(fā)病過程〔8〕，但其機制尚不清楚。本文旨在探討MicroRNA(MiR)-499b在老年CHF患者中的表達情況，并且探究該條件下MiR-499b對血清Hcy水平的影響。

1材料與試劑

1.1細胞與試劑293T細胞由本實驗室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購自研科生物公司；一抗及二抗購自武漢三鷹公司；細胞培養(yǎng)板購自Costar公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Pierce Chemical公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過硫酸銨、脫脂奶粉購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.2儀器倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；-80℃冰箱為中國海爾集團產品；板式酶標儀購自北京市新風機電技術公司；電泳儀及轉膜儀購自美國Bio-Rad公司；單光子儀。

1.3方法

1.3.1原位雜交對含有30例老年CHF患者的組織芯片進行原位雜交實驗，檢測組織中MiR-499b的表達情況。

1.3.2細胞培養(yǎng)293T細胞用含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用含0.02%EDTA 的0.25% 胰酶消化液消化細胞，并進行傳代，傳至4、5代左右，選取生長狀態(tài)良好、增殖旺盛的細胞用于實驗研究。

1.3.3建立穩(wěn)定干擾MiR-499b的細胞系293T細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，置細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞做實驗。在六孔板中種入生長狀態(tài)良好的細胞，當細胞密度達到50%～60%時，將轉染細胞分3組:(1)293T細胞:常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理;(2)anti-miR-NC/293T細胞:瞬時轉染插入空載質粒;(3)干擾MiR-499b的293T細胞(anti-miR-499b):瞬時轉染插入MiR-499b目標片段 5'-GTTTATTAAGTCACATGCT-3'和 5'-CATCAATTCTGTGCTCTGG-3'。同時用脂質體2000進行平行轉染，6 h以后換液，用G418進行篩選，利用Western印跡進行鑒定。

1.3.4Hcy檢測利用試劑盒(上?？迫A生物工程股份公司)提供的循環(huán)酶法檢測293T細胞、anti-miR-NC/293T細胞和干擾MiR-499b的293T細胞(anti-miR-499b)中Hcy含量。

1.3.5MTHFR和TNF-α mRNA表達的檢測首先用TRIzol提取細胞總RNA，將總RNA逆轉錄合成cDNA。反應條件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以產物cDNA 為模板，使用實時PCR檢測MTHFR和TNF-α mRNA的相對表達量，每個樣品設置3個復孔。內參照為GAPDH。各引物序列:MTHFR正向序列5'-GTCACCGAGGTCTGAAACAAG-3'，反向序列5'-TCTGGGACCTGAGGTAGAGG-3';GAPDH 正向序列5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，反向序列5'-TCTAGTCGACGGCAGAGGTC-3'。實時PCR反應條件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個循環(huán)。溶解曲線條件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。根據(jù)反應結束后的Ct值(每個反應管內的熒光信號達到設定的域值時對應的循環(huán)數(shù))，通過2-△△Ct法計算樣品中多種mRNA 的相對表達量，所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳驗證。

1.3.6熒光素酶活性檢測將293T細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細胞生長至70%～85%融合度時，共轉染熒光素酶報告載體及陰性對照、anti-miR-NC和anti-miR-499b。以轉染pRL-TK作為標準內質控。轉染48 h后，收獲細胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細胞熒光素酶活性：棄去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，然后每孔加入已稀釋的1×PLB裂解細胞10 min。將細胞刮下，收集至1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清。取25 μl上清，加入熒光素酶檢測試劑LARll 100 μl，記錄螢火蟲熒光素酶活性值；然后加入stop&Glo試劑100 μl，記錄海腎熒光素酶活性值。計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3.7相關蛋白表達的檢測采用 Western印跡法。

1.3.7.1蛋白樣品的獲得蛋白裂解液的配制(100 μl)：取100×蛋白酶抑制劑 1 μl，加蛋白裂解液至100 μl。蛋白抽提：用預冷的D-Hank液清洗3次，每一個孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細胞刮刀將孔中細胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，4℃ 12 000 r/min離心30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.3.7.2BCA法蛋白定量采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進行。

1.3.7.3蛋白變性按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7.4Western印跡分析(1)電泳：根據(jù)待檢測蛋白質的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍染料跑出膠后停止電泳，冰上進行。(2)轉膜：斷掉電源，取出電泳板，根據(jù)樣品數(shù)量及蛋白分子量大小剪下合適大小的膠，用尺子量好長和寬后放置于盛有轉膜液的平皿中。根據(jù)膠的尺寸裁剪合適孔徑的PVDF膜以及專用濾紙，按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙順序放置，將轉膜板卡緊，放入轉膜槽中，打開電源100 V恒壓轉膜1～2 h(根據(jù)蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的轉膜時間久)。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說明書用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：將PVDF膜轉入洗膜盒中，正面向上，加入適量的TBST液體，置于搖床上下洗滌3次，10 min/次。(6)二抗孵育：根據(jù)實驗所用一抗的種屬選擇對應的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：將PVDF膜轉入洗膜盒中，正面向上，加入適量的TBST液體，置于搖床上下洗滌3次，10 min/次。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學顯影液，使之覆蓋膜的整個表面，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件進行t檢驗。

2結果

2.1在老年CHF患者的組織芯片中檢測MiR-499b的表達情況原位雜交實驗檢測發(fā)現(xiàn)，老年CHF患者體內MiR-449b mRNA的表達水平發(fā)生異常性減少。見圖1。

2.2穩(wěn)定轉染干擾MiR-499b的293T細胞系的鑒定通過實時熒光定量檢測mRNA水平，陰性對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-499b組MiR-499b mRNA表達水平依次為1.0±0.77、0.97±0.80、0.33±0.39，干擾效率達到70%以上，結果可信。

2.3Hcy含量的測定干擾MiR-499b的293T細胞系產生的Hcy含量(3.87±1.1)明顯高于其他兩組(陰性對照組1.1±0.29,anti-miR-NC組0.96±0.47)(P<0.05)；而其他兩組之間的Hcy含量無統(tǒng)計學差異。

2.4MiR-499b MTHFR和TNF-α mRNA表達的檢測干擾MiR-499b組的MTHFR mRNA表達量相比對照組明顯降低；干擾MiR-499b組的TNF-α mRNA表達量相比對照組明顯升高(P<0.05)。DNA凝膠電泳顯示一致的結果，見表1，圖2。

圖1　正常組與CHF組MiR-499b mRNA表達水平

組別TNF-αmRNAMTHYmRNA陰性對照組0.31±1.051)1.03±0.41)anti-miR-NC組0.34±0.671)1.1±0.191)anti-miR-499b組0.96±0.890.54±0.39

與anti-miR-499b組比較:1)P<0.05

圖2　DNA凝膠電泳圖

2.5熒光素報告分析結果通過在線靶基因軟件預測發(fā)現(xiàn)，MiR-499b可能與MTHFR mRNA的3'-UTR片段3 864～4 060 bp相結合，且該結合位點在多物種間高度保守。構建報告載體后，通過熒光素活性檢測，結果顯示，與MiR-499b組比較，anti-miR-499b能夠明顯抑制MTHFR-Mt報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但是對突變型的MTHFR-Mut無明顯抑制作用。見圖3。

圖3　miR-499b對MTHFR mRNA的3'-UTR的調控情況

2.6利用已經鑒定成功構建的anti-miR-499b 293T細胞系進行恢復實驗向anti-miR-499b 293T細胞中轉入anti-miR-499抑制劑恢復MiR-499b的表達水平，檢測MTHFR和TNF-α的蛋白水平，當MiR-499b過表達時MTHFR蛋白表達水平顯著上升(P<0.05)，而TNF-α蛋白水平顯著下降。見圖4。

A: control;B: NC;C: anti-miRNA-499b抑制劑;D:anti-miRNA-499b圖4　miR-499b的變化對MTHFR和TNF-α蛋白水平的影響

3討論

根據(jù)統(tǒng)計，老年CHF患者大多存在蛋白質代謝失衡，研究表明血漿中的NT-proBNP、TNF-α等因子也在CHF的發(fā)生過程中存在著異常活化的情況〔9～11〕。根據(jù)現(xiàn)有報道證明，在CHF時，MicroRNA會發(fā)生表達水平的異常，而這些異常性變化可能會對該病的發(fā)生和發(fā)展產生影響〔12，13〕。事實上,MicroRNA可以抑制或促進CHF的進程,靶向其下游目標〔14〕。

本研究提示，MiR-499b在CHF中可能是作為一種抑制疾病發(fā)生方面的因子行使功能。本實驗發(fā)現(xiàn)，沉默MiR-499b后，對Hcy的產生能力存在影響，MiR-499b的沉默能夠明顯降低MTFHR的表達能力。本實驗進一步說明體內容易發(fā)生蛋白質代謝的混亂；另外，MiR-499b能夠降低TNF-α的表達水平，還能夠降低炎癥的發(fā)生，減緩CHF的進程。

總之，老年CHF與MiR-499b低表達有關。Mir-499b可以

通過增強MTFHR的表達來降低Hcy的積累，維持體內的蛋白質平衡；并且Mir-499b也可以通過降低TNF-α的表達來減緩炎癥的發(fā)展進程，從而減緩CHF的發(fā)展速度。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：海南省衛(wèi)計委科研項目(14A200043)

〔中圖分類號〕R541

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2860-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.015

第一作者：王晟(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事老年病研究。