王　晟　龍　靜　胡金牛　鄧炳取　占達(dá)良　譚戰(zhàn)榮

(海口市第三人民醫(yī)院老年病科，海南　?？凇?71100)

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MicroRNA-499b通過亞甲基四氫葉酸還原酶調(diào)節(jié)老年慢性心力衰竭患者血清同型半胱氨酸水平的機(jī)制及意義

王晟龍靜胡金牛鄧炳取占達(dá)良譚戰(zhàn)榮

(?？谑械谌嗣襻t(yī)院老年病科，海南海口571100)

〔摘要〕目的探究MicroRNA(MiR)-499b在老年慢性心力衰竭(CHF)患者中的表達(dá)情況及其對血清同型半胱氨酸(Hcy)含量的影響。方法利用老年CHF患者的組織芯片，通過原位雜交檢測MiR-499b mRNA表達(dá)水平；利用熒光素酶和Western印跡檢測MiR-499b對其靶基因亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)的表達(dá)調(diào)控；通過檢測血清中的Hcy表達(dá)情況，顯示MiR-499b和MTHFR對Hcy逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的影響；利用熒光素酶和Western印跡實(shí)驗(yàn)檢測MiR-499b對腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達(dá)調(diào)控，顯示MiR-499b和TNF-α對CHF逆轉(zhuǎn)產(chǎn)生的影響。結(jié)果MiR-499b在老年CHF患者中顯著降低，并且正向調(diào)控MTHFR的表達(dá)水平；MiR-499b直接靶向調(diào)控MTHFR啟動子活性，增高M(jìn)THFR的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Hcy的表達(dá)水平，并且發(fā)現(xiàn)MiR-499b能夠靶向調(diào)控TNF-α，降低其表達(dá)水平，進(jìn)而CHF炎癥水平，降低心衰發(fā)生率。結(jié)論MiR-499b的低表達(dá)與血清Hcy的異常表達(dá)具有顯著相關(guān)性，MiR-499b通過增強(qiáng)MTHFR的表達(dá)降低血清Hcy的表達(dá)量；MiR-499b能夠降低TNF-α的表達(dá)水平，減少CHF的發(fā)生。

〔關(guān)鍵詞〕慢性心力衰竭;同型半胱氨酸;MicroRNA;腫瘤壞死因子-α

慢性心力衰竭(CHF)患者中普遍存在蛋白質(zhì)定性和定量缺乏，這將導(dǎo)致肌肉和內(nèi)臟蛋白質(zhì)代謝混亂〔1,2〕。通過檢測血清中的同型半胱氨酸(Hcy)水平可以初步判斷患者體內(nèi)是否存在蛋白質(zhì)代謝異?！?～5〕。亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因突變是導(dǎo)致血漿 Hcy 輕度升高的重要原因〔6〕;CHF患者體內(nèi)，某些炎癥因子的表達(dá)也存在異常升高，如腫瘤壞死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6等〔7〕。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報道，MicroRNAs可能參與CHF的發(fā)病過程〔8〕，但其機(jī)制尚不清楚。本文旨在探討MicroRNA(MiR)-499b在老年CHF患者中的表達(dá)情況，并且探究該條件下MiR-499b對血清Hcy水平的影響。

1材料與試劑

1.1細(xì)胞與試劑293T細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胎牛血清購自以色列Biolnd公司；胰蛋白酶購自研科生物公司；一抗及二抗購自武漢三鷹公司；細(xì)胞培養(yǎng)板購自Costar公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Pierce Chemical公司，5×SDS蛋白上樣緩沖液、SDS、Tris、甘氨酸、TEMED、30%Acr-Bis(29∶1)、Glycine、Tween20、過硫酸銨、脫脂奶粉購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；D-Hank緩沖液為自行配制。

1.2儀器倒置顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma公司；-80℃冰箱為中國海爾集團(tuán)產(chǎn)品；板式酶標(biāo)儀購自北京市新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司；單光子儀。

1.3方法

1.3.1原位雜交對含有30例老年CHF患者的組織芯片進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，檢測組織中MiR-499b的表達(dá)情況。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)293T細(xì)胞用含有15%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。用含0.02%EDTA 的0.25% 胰酶消化液消化細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，傳至4、5代左右，選取生長狀態(tài)良好、增殖旺盛的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

1.3.3建立穩(wěn)定干擾MiR-499b的細(xì)胞系293T細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)。在六孔板中種入生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到50%～60%時，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分3組:(1)293T細(xì)胞:常規(guī)培養(yǎng)，不做任何處理;(2)anti-miR-NC/293T細(xì)胞:瞬時轉(zhuǎn)染插入空載質(zhì)粒;(3)干擾MiR-499b的293T細(xì)胞(anti-miR-499b):瞬時轉(zhuǎn)染插入MiR-499b目標(biāo)片段 5'-GTTTATTAAGTCACATGCT-3'和 5'-CATCAATTCTGTGCTCTGG-3'。同時用脂質(zhì)體2000進(jìn)行平行轉(zhuǎn)染，6 h以后換液，用G418進(jìn)行篩選，利用Western印跡進(jìn)行鑒定。

1.3.4Hcy檢測利用試劑盒(上?？迫A生物工程股份公司)提供的循環(huán)酶法檢測293T細(xì)胞、anti-miR-NC/293T細(xì)胞和干擾MiR-499b的293T細(xì)胞(anti-miR-499b)中Hcy含量。

1.3.5MTHFR和TNF-α mRNA表達(dá)的檢測首先用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件:42℃ 60 min，70℃ 10 min。以產(chǎn)物cDNA 為模板，使用實(shí)時PCR檢測MTHFR和TNF-α mRNA的相對表達(dá)量，每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔。內(nèi)參照為GAPDH。各引物序列:MTHFR正向序列5'-GTCACCGAGGTCTGAAACAAG-3'，反向序列5'-TCTGGGACCTGAGGTAGAGG-3';GAPDH 正向序列5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'，反向序列5'-TCTAGTCGACGGCAGAGGTC-3'。實(shí)時PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s，95℃ 15 s，60℃ 30 s，共39個循環(huán)。溶解曲線條件:95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃15 s。根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的Ct值(每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù))，通過2-△△Ct法計算樣品中多種mRNA 的相對表達(dá)量，所得產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.6熒光素酶活性檢測將293T細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至70%～85%融合度時，共轉(zhuǎn)染熒光素酶報告載體及陰性對照、anti-miR-NC和anti-miR-499b。以轉(zhuǎn)染pRL-TK作為標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)質(zhì)控。轉(zhuǎn)染48 h后，收獲細(xì)胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞熒光素酶活性：棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，然后每孔加入已稀釋的1×PLB裂解細(xì)胞10 min。將細(xì)胞刮下，收集至1.5 ml EP管中，12 000 r/min離心3 min，取上清。取25 μl上清，加入熒光素酶檢測試劑LARll 100 μl，記錄螢火蟲熒光素酶活性值；然后加入stop&Glo試劑100 μl，記錄海腎熒光素酶活性值。計算相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3.7相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測采用 Western印跡法。

1.3.7.1蛋白樣品的獲得蛋白裂解液的配制(100 μl)：取100×蛋白酶抑制劑 1 μl，加蛋白裂解液至100 μl。蛋白抽提：用預(yù)冷的D-Hank液清洗3次，每一個孔加入蛋白裂解液，將其置于冰上裂解30 min，用細(xì)胞刮刀將孔中細(xì)胞小心刮下并收集到1.5 ml EP管中，4℃ 12 000 r/min離心30 min，離心完畢后將其取出置于冰上，分裝備用。

1.3.7.2BCA法蛋白定量采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進(jìn)行。

1.3.7.3蛋白變性按比例加入5×SDS蛋白上樣緩沖液，置于金屬浴中95℃孵育10 min后立即置于冰上冷卻，最后放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7.4Western印跡分析(1)電泳：根據(jù)待檢測蛋白質(zhì)的大小選擇合適濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每泳道上樣40 μg，先70 V電泳30 min，再130 V電泳至溴酚藍(lán)染料跑出膠后停止電泳，冰上進(jìn)行。(2)轉(zhuǎn)膜：斷掉電源，取出電泳板，根據(jù)樣品數(shù)量及蛋白分子量大小剪下合適大小的膠，用尺子量好長和寬后放置于盛有轉(zhuǎn)膜液的平皿中。根據(jù)膠的尺寸裁剪合適孔徑的PVDF膜以及專用濾紙，按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙順序放置，將轉(zhuǎn)膜板卡緊，放入轉(zhuǎn)膜槽中，打開電源100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1～2 h(根據(jù)蛋白的大小不同而不同，蛋白分子量大的轉(zhuǎn)膜時間久)。(3)封閉：5%脫脂牛奶，用TBST稀釋，室溫封閉1 h。(4)一抗孵育：按照抗體說明書用TBST將一抗稀釋到適合的比例。 (5)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，正面向上，加入適量的TBST液體，置于搖床上下洗滌3次，10 min/次。(6)二抗孵育：根據(jù)實(shí)驗(yàn)所用一抗的種屬選擇對應(yīng)的二抗，并用TBST將二抗稀釋到適合的比例，并將其置于搖床上室溫孵育1 h。(7)洗膜：將PVDF膜轉(zhuǎn)入洗膜盒中，正面向上，加入適量的TBST液體，置于搖床上下洗滌3次，10 min/次。(8)顯影：在膜表面滴入適量的HRP化學(xué)顯影液，使之覆蓋膜的整個表面，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1在老年CHF患者的組織芯片中檢測MiR-499b的表達(dá)情況原位雜交實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，老年CHF患者體內(nèi)MiR-449b mRNA的表達(dá)水平發(fā)生異常性減少。見圖1。

2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾MiR-499b的293T細(xì)胞系的鑒定通過實(shí)時熒光定量檢測mRNA水平，陰性對照組、anti-miR-NC組、anti-miR-499b組MiR-499b mRNA表達(dá)水平依次為1.0±0.77、0.97±0.80、0.33±0.39，干擾效率達(dá)到70%以上，結(jié)果可信。

2.3Hcy含量的測定干擾MiR-499b的293T細(xì)胞系產(chǎn)生的Hcy含量(3.87±1.1)明顯高于其他兩組(陰性對照組1.1±0.29,anti-miR-NC組0.96±0.47)(P<0.05)；而其他兩組之間的Hcy含量無統(tǒng)計學(xué)差異。

2.4MiR-499b MTHFR和TNF-α mRNA表達(dá)的檢測干擾MiR-499b組的MTHFR mRNA表達(dá)量相比對照組明顯降低；干擾MiR-499b組的TNF-α mRNA表達(dá)量相比對照組明顯升高(P<0.05)。DNA凝膠電泳顯示一致的結(jié)果，見表1，圖2。

圖1　正常組與CHF組MiR-499b mRNA表達(dá)水平

組別TNF-αmRNAMTHYmRNA陰性對照組0.31±1.051)1.03±0.41)anti-miR-NC組0.34±0.671)1.1±0.191)anti-miR-499b組0.96±0.890.54±0.39

與anti-miR-499b組比較:1)P<0.05

圖2　DNA凝膠電泳圖

2.5熒光素報告分析結(jié)果通過在線靶基因軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，MiR-499b可能與MTHFR mRNA的3'-UTR片段3 864～4 060 bp相結(jié)合，且該結(jié)合位點(diǎn)在多物種間高度保守。構(gòu)建報告載體后，通過熒光素活性檢測，結(jié)果顯示，與MiR-499b組比較，anti-miR-499b能夠明顯抑制MTHFR-Mt報告載體的熒光素酶活性(P<0.05)，但是對突變型的MTHFR-Mut無明顯抑制作用。見圖3。

圖3　miR-499b對MTHFR mRNA的3'-UTR的調(diào)控情況

2.6利用已經(jīng)鑒定成功構(gòu)建的anti-miR-499b 293T細(xì)胞系進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)向anti-miR-499b 293T細(xì)胞中轉(zhuǎn)入anti-miR-499抑制劑恢復(fù)MiR-499b的表達(dá)水平，檢測MTHFR和TNF-α的蛋白水平，當(dāng)MiR-499b過表達(dá)時MTHFR蛋白表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)，而TNF-α蛋白水平顯著下降。見圖4。

A: control;B: NC;C: anti-miRNA-499b抑制劑;D:anti-miRNA-499b圖4　miR-499b的變化對MTHFR和TNF-α蛋白水平的影響

3討論

根據(jù)統(tǒng)計，老年CHF患者大多存在蛋白質(zhì)代謝失衡，研究表明血漿中的NT-proBNP、TNF-α等因子也在CHF的發(fā)生過程中存在著異?；罨那闆r〔9～11〕。根據(jù)現(xiàn)有報道證明，在CHF時，MicroRNA會發(fā)生表達(dá)水平的異常，而這些異常性變化可能會對該病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響〔12，13〕。事實(shí)上,MicroRNA可以抑制或促進(jìn)CHF的進(jìn)程,靶向其下游目標(biāo)〔14〕。

本研究提示，MiR-499b在CHF中可能是作為一種抑制疾病發(fā)生方面的因子行使功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默MiR-499b后，對Hcy的產(chǎn)生能力存在影響，MiR-499b的沉默能夠明顯降低MTFHR的表達(dá)能力。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明體內(nèi)容易發(fā)生蛋白質(zhì)代謝的混亂；另外，MiR-499b能夠降低TNF-α的表達(dá)水平，還能夠降低炎癥的發(fā)生，減緩CHF的進(jìn)程。

總之，老年CHF與MiR-499b低表達(dá)有關(guān)。Mir-499b可以

通過增強(qiáng)MTFHR的表達(dá)來降低Hcy的積累，維持體內(nèi)的蛋白質(zhì)平衡；并且Mir-499b也可以通過降低TNF-α的表達(dá)來減緩炎癥的發(fā)展進(jìn)程，從而減緩CHF的發(fā)展速度。

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

基金項(xiàng)目：海南省衛(wèi)計委科研項(xiàng)目(14A200043)

〔中圖分類號〕R541

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2860-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.015

第一作者：王晟(1967-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事老年病研究。