馮繼澤　周敬淳　謝娟華

(深圳市龍華新區(qū)龍華人民醫(yī)院麻醉科，廣東　深圳　518109)

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氟馬西尼對鹽酸氯胺酮麻醉大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響

馮繼澤周敬淳1謝娟華

(深圳市龍華新區(qū)龍華人民醫(yī)院麻醉科，廣東深圳518109)

〔摘要〕目的探討氟馬西尼對鹽酸氯胺酮注射液麻醉后大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其可能機(jī)制。方法選擇60只健康清潔級 SD 大鼠，隨機(jī)分成對照組、氯胺酮組、氟馬西尼組各20只。對照組：第1天腹腔注射生理鹽水，第2～6天無藥物處理。氯胺酮組：第1天腹腔注射鹽酸氯胺酮(80 mg/kg)，從第2開始每日腹腔注射生理鹽水，持續(xù)至第6天。氟馬西尼組：第1天腹腔注射鹽酸氯胺酮(80 mg/kg) ，從第2天開始每日腹腔注射氟馬西尼(4 mg/kg)，持續(xù)至第6天。采用 Morris 水迷宮檢測氟馬西尼對鹽酸氯胺酮所致學(xué)習(xí)記憶障礙的影響，同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)方法檢測各組大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長因子(NGF)的含量，并采用Western印跡檢測各組大鼠海馬組織cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cREB)、磷酸化cREB(p-cREB)、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、p-ERK的表達(dá)水平。結(jié)果第2天和第3天時(shí)各組間逃避潛伏期均無顯著差異；第4～6天，與對照組相比，氯胺酮組尋找平臺的逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)。與氯胺酮組相比，氟馬西尼組的逃避潛伏期于第5～6天時(shí)縮短明顯(P<0.05)。氯胺酮組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)少于氟馬西尼組(P<0.05)。氟馬西尼組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)少于對照組(P<0.05)。與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬勻漿中 NGF、BDNF 的含量下降，與氯胺酮組比較，氟馬西尼組含量增加(均P<0.05)。與對照組相比，氯胺酮組海馬p-cREB、p-ERK的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與氯胺酮組比較，氟馬西尼組表達(dá)水平均顯著增加(均P<0.05)。結(jié)論氟馬西尼可能通過增加NGF 和BDNF 表達(dá)水平，激活ERK、cREB 信號通路，從而改善鹽酸氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。

〔關(guān)鍵詞〕氟馬西尼；鹽酸氯胺酮；麻醉；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)；神經(jīng)營養(yǎng)因子

1資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑健康清潔級SD大鼠(昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。鹽酸氯胺酮注射液(西安力邦制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20054749)；氟馬西尼注射液(宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，國藥準(zhǔn)字H20113191)。Morris 水迷宮儀(上海欣軟信息科技有限公司提供)。神經(jīng)生長因子(NGF)及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF) 檢測試劑盒(美國Rapidbio公司提供)。

1.2動(dòng)物分組及處理選擇60只健康清潔級SD大鼠，體重400～450 g，隨機(jī)分成對照組、氯胺酮組、氟馬西尼組各20只。試驗(yàn)前，SD 大鼠均適應(yīng)性馴養(yǎng)1 w，自由攝食飲水。對照組：第1天腹腔注射生理鹽水，第2～6天無藥物處理。氯胺酮組：第 1天腹腔注射鹽酸氯胺酮(80 mg/kg)，從第2開始每日腹腔注射生理鹽水，持續(xù)至第6天。氟馬西尼組：第1天腹腔注射鹽酸氯胺酮(80 mg/kg)，從第2天開始每日腹腔注射氟馬西尼(4 mg/kg) ，持續(xù)至第6天。

1.3觀察指標(biāo)(1)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：①大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)。第1天于麻醉前讓大鼠自由游泳 2 min，熟悉迷宮環(huán)境。從第2天起，每天注射藥物2 h 后，對大鼠進(jìn)行4 次訓(xùn)練，每次訓(xùn)練間隔60 s。從 4 個(gè)不同入水點(diǎn)將大鼠面向池壁分別放入水中，記錄各組大鼠爬上平臺所需的時(shí)間(逃避潛伏期)。找到平臺后，讓大鼠停留于平臺上10 s。如果在2 min內(nèi)大鼠未找到平臺，則人為地將其引至平臺上停留10 s，此時(shí)潛伏期記為120 s。②大鼠空間探索實(shí)驗(yàn)：在第6天最后一次訓(xùn)練后，撤除平臺。在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測量大鼠在 120 s 內(nèi)跨過原平臺位置的次數(shù)。(2)海馬區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測〔3〕：Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，SD 大鼠斷頭開顱取腦。將大鼠海馬組織用4℃生理鹽水迅速制成1∶9勻漿液，3 000 r/min 離心15 min，取上清液，用于各組大鼠海馬組織NGF 和BDNF 含量的檢測。NGF 和 BDNF 的檢測采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。(3)海馬區(qū)磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)和磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(p-cREB)表達(dá)水平的檢測〔3〕：Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，SD 大鼠斷頭開顱取腦。分離大鼠海馬組織，放入玻璃研磨器中磨碎為分散的細(xì)胞。加入0.5 ml 的細(xì)胞裂解液冰上裂解45 min，15 000 r/min離心15 min，取上清液，-80℃保存。用免疫Western印跡法檢測各組大鼠海馬組織cREB、p-cREB、ERK、p-ERK的表達(dá)水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1定位航向?qū)嶒?yàn)經(jīng)過5 d的隱匿平臺訓(xùn)練，各組逃避潛伏期呈逐漸縮短的趨勢。第2天和第3天時(shí)各組間逃避潛伏期均無顯著差異；第4～6天，與對照組相比，氯胺酮組尋找平臺的逃避潛伏期明顯延長，與氯胺酮組相比，氟馬西尼組的逃避潛伏期于第5～6天時(shí)縮短明顯(均P<0.05)。見表1。

2.2空間探索實(shí)驗(yàn)氯胺酮組大鼠穿越原平臺位置次數(shù)〔(3.7±0.6)次〕少于氟馬西尼組〔(4.7±0.8)次〕，氟馬西尼組少于對照組〔(7.1±0.9)次〕(均P<0.05)。

2.3各組神經(jīng)營養(yǎng)因子水平比較與對照組相比，氯胺酮組大鼠海馬勻漿中 NGF、BDNF 的含量下降，與氯胺酮組比較，氟馬西尼組含量增加(均P<0.05)。見表2。

表1　各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期的比較 ±s,n=20,s)

與對照組比較：1)P<0.05；與氯胺酮組比較：2)P<0.05；下表同

表2　各組大鼠海馬區(qū) NGF、BDNF 表達(dá)的比較

2.4各組大鼠海馬cREB、p-cREB、ERK、p-ERK的表達(dá)Western印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，氯胺酮組及氟馬西尼組大鼠海馬總cREB、ERK蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，氯胺酮組海馬p-cREB、p-ERK的蛋白表達(dá)水平均顯著降低，與氯胺酮組比較，氟馬西尼組表達(dá)水平均顯著增加(均P<0.05)。見圖 1。

圖1　各組大鼠海馬cREB、p-cREB、ERK、p-ERK的表達(dá)

3討論

神經(jīng)營養(yǎng)因子在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中能夠促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖、生長、分化和存活，并可調(diào)節(jié)突觸的可塑性，其中以NGF及BDNF最為重要。文獻(xiàn)表明〔7〕，NGF 和 BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子在改善認(rèn)知功能方面具有十分重要的作用，可以改善老年癡呆模型鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，促進(jìn)神經(jīng)元的生長。在成熟的神經(jīng)系統(tǒng)中，NGF和 BDNF 具有維持神經(jīng)細(xì)胞生存的作用。文獻(xiàn)還表明〔8〕，NGF 和 BDNF 表達(dá)水平的增加能夠促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)如乙酰膽堿的合成，并對膽堿能神經(jīng)元起營養(yǎng)作用，改善動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果提示氟馬西尼可以阻止氯胺酮所致 NGF 和 BDNF 表達(dá)水平的減少，以維持膽堿能神經(jīng)元的活性，從而改善鹽酸氯胺酮注射液麻醉所致大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。

cREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，具有調(diào)節(jié)包括學(xué)習(xí)記憶在內(nèi)的廣泛的生物學(xué)功能〔9〕。ERK〔10〕是傳遞絲裂原信號的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)。文獻(xiàn)表明〔11〕，氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙與其對ERK 和cREB活性的抑制有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，氟馬西尼可能通過增加NGF 和BDNF 表達(dá)水平，激活ERK-cREB 信號通路，從而改善鹽酸氯胺酮所致的學(xué)習(xí)記憶障礙。

4參考文獻(xiàn)

1王曉軍，羅鐵山，趙濤，等.3種不同麻醉藥物對老年患者腹部手術(shù)后認(rèn)知功能障礙的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2015;35(9)：2544-5.

2Hudetz JA，Iqbal Z，Gandhi SD，etal.Ketamine attenuates post-operative cognitive dysfunction after cardiac surgery〔J〕.Acta Anaesthesiol Scand,2009；53(7)：864-72.

3鄧昌，歐陽波，陶然，等.人參皂甙對氯胺酮麻醉后老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014;34(4)：955-8.

4Geller E，Crome P，Schaller MD，etal.Risks and benefits of therapy with flumazenil (Anexate) in mixed drug intoxications〔J〕.Eur Neurol,1991；31(4)：241-50.

5Olkkola KT，Ahonen J.Midazolam and other benzodiazepines〔J〕.Handb Exp Pharmacol,2008；(182)：335-60.

6Hoffman EJ，Warren EW.Flumazenil：a benzodiazepine antagonist〔J〕.Clin Pharm,1993；12(9)：641-56.

7Filus JF，Rybakowski J.Neurotrophic factors and their role in the pathogenesis of affective disorders〔J〕.Psychiatry Pol,2005；39(5)：883-97.

8Mele T，Juric DM.Metrifonate，like acetylcholine，up-regulates neurotrophic activity of cultured rat astrocytes〔J〕.Pharmacol Rep,2014；66(4)：618-23.

9Lee D.Global and local missions of cAMP signaling in neural plasticity，learning，and memory〔J〕.Front Pharmacol，2015；6(2)：161.

10Sweatt JD，Weeber EJ.Genetics of childhood disorders：LII.Learning and memory，part 5：human cognitive disorders and the ras/ERK/CREB pathway〔J〕.J Am Acad Child Adolesc Psychiatry，2003；42(7)：873-6.

11Peng S，Yang X，Liu GJ，etal.From the camp pathway to search the ketamine-related learning and memory〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2015；19(1)：161-4.

〔2015-10-25修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

基金項(xiàng)目：深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目 (No.201401006)

〔中圖分類號〕R338

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2856-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.013

1深圳市人民醫(yī)院耳鼻喉科

第一作者：馮繼澤(1960-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事麻醉科研究。