闞伯紅　高　青　胡先同　王一婧　趙　嵐　范英昌

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所　天津市針灸學重點實驗室，天津　300381)

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·基礎研究·

心復康含藥血清對心臟干細胞中縫隙連接蛋白43水平的影響

闞伯紅高青1胡先同1王一婧1趙嵐范英昌1

(天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院針灸研究所天津市針灸學重點實驗室，天津300381)

〔摘要〕目的探討心復康含藥血清對心臟干細胞分化的促進作用。方法采用細胞免疫熒光方法對傳代后心臟干細胞進行檢測，采用實時熒光定量PCR和Western印跡分別檢測心臟干細胞中縫隙連接蛋白(Cx43)mRNA和蛋白表達。結(jié)果5%心復康含藥血清培養(yǎng)72 h后，心臟干細胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平明顯提高(P<0.05)。結(jié)論心復康含藥血清具有促進心臟干細胞分化的作用，有利于闡明心復康治療心肌梗死的作用機制。

〔關(guān)鍵詞〕心臟干細胞；心復康

急性心肌梗死(AMI)多數(shù)臨床支持療法著重于調(diào)節(jié)血流動力學、減低早期死亡率，但不利于心臟的修復和減少心力衰竭的發(fā)生。修復梗死心肌的最終目標是再生健康的、有功能的、可以和周圍心肌細胞相整合的心肌組織，被普遍接受的治療方法是通過增加組織再生促進愈合和抑制病理重塑〔1〕。心肌干細胞(CSCs)具有定向分化為心臟細胞的趨勢，在AMI及缺血性心肌病的修復中發(fā)揮著重要作用。促進CSCs的增殖和分化對于心肌細胞再生的臨床治療是一個巨大挑戰(zhàn)。本文通過檢測心復康含藥血清對CSCs中縫隙連接蛋白(Cx)43轉(zhuǎn)錄和表達的影響，闡明心復康對心肌分化的干預作用。

1材料與方法

1.1材料18s RNA(76 bp)上游引物：5′-CGAGCCGCCTGGATACC-3′，下游引物：5′-CCTCAGTTCCGAAAACCAACAA-3′；Cx43 NM_010288.3(101 bp)上游引物：5′-GATCGCGTGAAGGGAAGAAG-3′，下游引物：5′-CAGCCATTGAAGTAAGCATATT-TTG-3′。親和素結(jié)合的兔抗大鼠/小鼠c-kit 抗體購自美國BD公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠Cx43購自英國Santa公司(1∶1 000)；兔抗大鼠/小鼠/人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)購自武漢博士德公司(1∶300)；異硫氰酸熒光素(FITC)標記的抗親和素IgG購自Ligend(1∶1 000)，DMEM/DF12 培養(yǎng)液和胎牛血清(FCS)(澳洲源血清)購自GIBCO，重組人堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購自美國invitrogen，F(xiàn)asline Cell cDNA Kit(TIANGEN：KR105)，q-PCR 試劑盒(CW0662)和UltraSYBR Mixture購自北京康為世紀生物科技有限公司，0.45 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore，化學增強發(fā)光法(ECL)試劑盒購自索萊寶，熒光顯微鏡(Leca DM3000，德國)，實時熒光PCR 系統(tǒng)(RochLightCycle 480，瑞士)，生物分光光度計(EppendoBioPhotometer，德國)，SIGMA 3-18K 臺式低溫高速離心機(SIGMA，德國)，Q/TLY001 型電泳裝置(北京市六一儀器廠，中國)，濕性轉(zhuǎn)膜儀(GE，美國)，凝膠成像系統(tǒng)(Biorad，美國)。

1.2方法

1.2.1含藥血清的制備參見文獻〔2〕。

1.2.2CSCs的培養(yǎng)C57 小鼠CSCs由美國西北大學醫(yī)學院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈。培養(yǎng)基成分〔3〕：DMEM/F12，10%澳洲源FCS，2 mmol/L 谷氨酰胺，0.1 mmol/L β巰基乙醇，1%非必需氨基酸，5 ng/ml bFGF。培養(yǎng)條件：37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，隔天換液并傳代。

1.2.3CSCs的免疫熒光鑒定CSCs消化分散后，接種于放好蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次洗10 min；換4%多聚甲醛固定15 min；再以PBS 洗3次，每次洗10 min；以鑷子取出蓋玻片貼于載玻片上；以封閉血清室溫封閉1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；以c-kit 一抗室溫孵育2 h；PBS 洗3次，每次10 min；FITC 標記的二抗避光孵育1 h；PBS 洗3 次，每次洗10 min；二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液室溫孵育5～10 min；PBS 洗3 次，每次洗10 min；滴加抗熒光淬滅封片液后封片；熒光顯微鏡下觀察并采集圖像；以PBS代替一抗，作為陰性對照。

1.2.4實驗分組和干預分為空白血清組和含藥血清組。細胞接種密度為1×105個/ml，CSCs基礎培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，空白血清組在原培養(yǎng)液中加入5%兔空白血清，含藥血清組在原培養(yǎng)液中加入5%含藥血清，37℃，5% CO2培養(yǎng)72 h。

1.2.5熒光定量PCR檢測Cx43 mRNA的表達量細胞cDNA快速制備參見試劑說明書，PCR 反應體系〔2×UltraSYBR Mixture(with ROX) 10 μl，10 μmol/L上、下游引物各1 μl，cDNA模板1 μl，RNase-Free水7 μl〕，PCR 反應條件：預變性 95℃，10 min，1個循環(huán)；延伸95℃、15 s，60℃、1 min，45個循環(huán)；溶解曲線分析95℃、15 s，60℃、1 min，97℃延伸，1個循環(huán)；cooling 40℃、30 s，1個循環(huán)。

1.2.6Western印跡法測定Cx43蛋白的表達量所提細胞總蛋白以二喹啉甲酸(BCA)法按試劑說明書測蛋白濃度，加入5倍上樣緩沖液。100℃變性5 min，瞬時離心。10%聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳。濕轉(zhuǎn)250 mA穩(wěn)流轉(zhuǎn)膜2 h。將膜蛋白面朝上，按試劑說明書加入兔抗小鼠多克隆抗體Cx43(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶300稀釋)各2 ml，密封于袋中，4℃過夜；室溫平衡30 min，去除一抗，用Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜，5 min×3次；蛋白面朝上，按試劑說明書加入1∶4 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG抗體各2 ml，密封于保鮮袋中，37℃震蕩1 h；去除二抗，用TBST洗PVDF膜，5 min×3次。按照試劑說明書配制發(fā)光液，與膜作用1 min，在凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并對所得條帶進行分析。

2結(jié)果

2.1CSCs免疫熒光鑒定結(jié)果以c-kit為一抗對CSCs進行標記，DAPI染核，發(fā)現(xiàn)雖經(jīng)數(shù)次傳代，但幾乎所有細胞均具有c-kit表達，表明所培養(yǎng)細胞基因穩(wěn)定，該培養(yǎng)條件適合CSCs培養(yǎng)，且能保持其干細胞潛能不變。見圖1。

2.2心復康含藥血清對CSCs中Cx43水平的影響經(jīng)5%心復康含藥血清培養(yǎng)72 h，心臟干細胞中Cx43的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平明顯提高(P<0.05)，見表1，圖2。

A.綠色熒光為c-kit陽性細胞；B.DAPI染核的藍色熒光與c-kit陽性細胞的綠色熒光的疊加圖1　心臟干細胞免疫熒光鑒定(×200)

組別Cx43mRNACx43蛋白空白血清組(3.19E-06)±(7.04E-07)2.04±0.04含藥血清組(1.15E-05)±(3.56E-06)1)5.16±0.171)

與空白血清組比較:1)P<0.05

圖2　心復康含藥血清對心臟干細胞中CX43蛋白表達的影響

3討論

Cx43作為心肌閏盤結(jié)構(gòu)中縫隙連接的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在細胞膜聚合形成的縫隙連接構(gòu)成介導細胞離子、小分子和信號分子等的跨膜交流的重要結(jié)構(gòu)基礎，對于心肌細胞的發(fā)育、分化和收縮功能均有著重要作用，是心肌細胞分化的標志物。本研究發(fā)現(xiàn)心復康含藥血清可明顯提高CSCs中Cx43的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平，具有促進心臟干細胞分化的作用。

c-kit陽性的CSCs 首先在大鼠心臟被鑒定，c-kit陽性是CSCs 最普遍特征，且這些細胞不表達骨髓細胞、神經(jīng)細胞、骨骼肌細胞或心肌細胞的轉(zhuǎn)錄因子或膜和胞質(zhì)蛋白，因此CSCs 不屬于譜系細胞〔4〕。Lin(-)c-kit陽性 CSCs 具有干細胞的三大特性——能夠自我修復、克隆性和多潛能，可以向心肌、平滑肌和內(nèi)皮細胞方向分化。在缺血心肌中，這些細胞和他們的克隆后代分化成的心肌細胞和形成的血管可重組為具有年輕細胞特征的心肌，大約構(gòu)成70%的心室組織。但當心肌大面積梗死時，相對有限的內(nèi)源性CSCs很難及時修復受損心肌，因此，通過干預措施促進CSCs的增殖和分化變得至關(guān)重要。

CSCs的增殖分化受多種因素調(diào)節(jié)，諸如旁分泌或自分泌、生長因子和藥物等。藥物相對于其他方法更加簡便、安全和有效。中藥在CSCs分化中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可以促進小鼠CSCs分化為心肌樣細胞〔5〕。心復康具有益氣活血的作用，能夠明顯改善AMI患者的臨床癥狀〔6〕。體外研究表明心復康可有效增強心肌細胞抗缺氧性損傷的能力〔7〕。西洋參為心復康的君藥，具有補氣養(yǎng)血之功效，可減輕大鼠AMI后心室重構(gòu)〔8〕。人參皂甙是西洋參中主要的有效成分，也是生理活性最顯著的物質(zhì)。有研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷RG1能夠明顯增加神經(jīng)干細胞的增殖〔9〕，增加環(huán)境依賴的骨髓干細胞在體外分化為內(nèi)皮分化〔10〕。因此，心復康可能通過代謝后的單體成分發(fā)揮促CSCs分化的作用，其確切機制有待進一步研究。

4參考文獻

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〔2015-06-17修回〕

(編輯袁左鳴)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No.81173413)；天津市高等學校發(fā)展基金項目(No.20120211)；天津市中醫(yī)藥管理局中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合科研專項課題(No.13079)

通訊作者：范英昌(1951-)，男，碩士，教授，博士生導師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療心血管疾病研究。

〔中圖分類號〕R542.2+2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2829-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.001

1天津中醫(yī)藥大學

第一作者：闞伯紅(1978-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療老年性相關(guān)疾病研究。