亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        鐵皮石斛原球莖多糖提取及脫蛋白工藝研究

        2016-08-01 06:49:21張英潔耿巖玲王曉1劉峰
        山東科學(xué) 2016年3期
        關(guān)鍵詞:鐵皮石斛提取多糖

        張英潔,耿巖玲,王曉1,,劉峰

        (1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟南250014;2.山東省分析測試中心,山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室,山東 濟南250014)

        ?

        鐵皮石斛原球莖多糖提取及脫蛋白工藝研究

        張英潔1,2,耿巖玲2,王曉1,2,劉峰2

        (1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟南250014;2.山東省分析測試中心,山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點實驗室,山東 濟南250014)

        摘要:研究了鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物中多糖提取工藝并進行了不同脫蛋白方法的比較。以提取溫度、提取時間和料液比三因素進行正交實驗,得到多糖最佳提取工藝為提取溫度90 ℃、提取時間60 min、料液比1∶40(g/mL),多糖提取率78.51%。通過一系列單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,分析比較Sevage法、鹽酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法脫蛋白工藝。結(jié)果顯示,Sevage法第5次洗脫效果最好,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)43.81 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)9.67 %;鹽酸在體積分?jǐn)?shù)25 %時效果最好,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)52.17 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.82 %;三氯乙酸質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高35.50%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.34 %;木瓜蛋白酶法反應(yīng)時間90 min、溫度70 ℃、酶含量30 U時,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.01 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.89 %,效果最為理想。

        關(guān)鍵詞:鐵皮石斛;多糖;提?。幻摰鞍?/p>

        鐵皮石斛(DerdrobiumofficinaleKimura et Migo),蘭科(Orchidaceae),石斛屬(Dendrobium),為亞熱帶附生型多年生草本植物,俗稱黑節(jié)草。鐵皮石斛是我國一種傳統(tǒng)的名貴中藥材,具備滋陰清熱、益胃生津和潤肺止咳等功效,列為九大仙草之首。常用于熱病傷津、口干煩渴和病后虛熱等多種病癥,具有降血糖[1]、抗腫瘤[2]、抗疲勞[3]、抗氧化[4]、抗高血壓[5]和免疫調(diào)節(jié)[6]的功效。

        鐵皮石斛中成分多種多樣,有多糖、生物堿、菲類[7]和聯(lián)芐類[8]、酚酸類[9]、氨基酸和微量元素[10]等,具有很好的生物活性[11]。其中多糖是其主要成分,在石斛中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高達 30 %以上。近些年,人們對多糖功效的認(rèn)識不斷提高,大量的研究表明鐵皮石斛多糖具有較強的抗腫瘤生物活性。如今,人們越來越注重養(yǎng)生,鑒于多糖是提高免疫和抗腫瘤的活性成分,鐵皮石斛的社會需求量也愈來愈大。由于長年毫無節(jié)制地采掘以及生存環(huán)境的破壞,使鐵皮石斛自然資源日漸枯竭。然而鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物的出現(xiàn),可以有效地緩解鐵皮石斛資源匱乏的現(xiàn)狀,恰好可以代替鐵皮石斛為人們所用,滿足大量的社會需求。目前對鐵皮石斛原球莖多糖脫蛋白工藝的研究較少,本實驗優(yōu)化了多糖提取工藝,研究比較了Sevage法、鹽酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4種脫蛋白工藝,得出鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物中多糖脫蛋白的最佳工藝,為擴大工業(yè)生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

        1實驗部分

        1.1實驗材料與設(shè)備

        鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物(大連普瑞康生物技術(shù)有限公司)。所用試劑均為分析純;無水乙醇、三氯乙酸以及濃鹽酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司);氯仿和正丁醇(天津市富宇精細化工有限公司);木瓜蛋白酶(Biosharp網(wǎng)站)。HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠);SB-5200D超聲波清洗機(寧新芝生物科技股份有限公司);旋渦混合器XH-T(金壇市醫(yī)療儀器廠);Genesys10S US-Vis (賽默飛世爾科技公司);電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司);80-Ⅱ醫(yī)用離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)。

        1.2石斛多糖的測定

        采用蒽酮-硫酸法,將濃硫酸加入糖中經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛,其與蒽酮反應(yīng)生成藍綠色糠醛衍生物,在一定范圍內(nèi),顏色的深淺與糖的含量成正比。

        準(zhǔn)確稱取0.2 g的蒽酮置于100 mL容量瓶中,加乙酸乙酯定容,搖勻;吸取250 mL于25 mL容量瓶中,定容,搖勻即得10 mg/mL的樣液。吸取250 μL置于另一個25 mL的容量瓶中,定容,搖勻,得到100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        分別精密吸取100 μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.0 mL,定容至10 mL,分別各取2.0 mL依次加入0.5 mL蒽酮-乙酸乙酯,5 mL濃硫酸,震蕩搖勻,立即置于水浴鍋中沸水保溫10 min,反應(yīng)完全冷卻至室溫后用紫外分光光度計測吸光度值A(chǔ)(在620 nm下)。以吸光度x為橫坐標(biāo),石斛多糖的質(zhì)量濃度y(mg/mL)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程Y=0.009x+0.007,R2=0.999。

        1.3多糖提取工藝優(yōu)化

        準(zhǔn)確稱取適量石斛粉末,加入適量水,在一定溫度下,水浴回流加熱,抽濾,濾渣回收,重復(fù)操作,收集濾液,旋蒸濃縮至原來體積的1/10,加入約4倍體積的無水乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達到約80 %,加入過程中不斷攪拌,靜置24 h,下層析出沉淀物收集凍干,得到粗多糖提取物。

        選擇提取溫度(A)、提取時間(B)和料液比(C)為主要因素,通過單因素水平實驗后,確定正交實驗因素水平取值,見表1。

        表1 L9(33)正交實驗因素水平表

        1.4多糖脫蛋白工藝優(yōu)化

        準(zhǔn)確稱取1.0 g多糖提取物,于100 mL容量瓶中定容,得到質(zhì)量濃度為0.01 g/mL多糖溶液,采用Sevage法、鹽酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4種方法脫蛋白。

        1.4.1Sevage法脫蛋白

        參考趙俊凌等[12]齒瓣石斛脫蛋白的方法,配制氯仿∶正丁醇為4∶1 (V/V)的溶液作為Sevage法脫蛋白所用的溶液。取20 mL配好的0.01 g/mL鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物多糖溶液放入分液漏斗中,按照4∶1(V/V)比例,加入Sevage溶液,在分液漏斗中充分混勻后,震蕩60 min棄去下相溶液,上相溶液留在離心管中,轉(zhuǎn)速3 500 r/min下離心5 min,取上清液再次洗脫,重復(fù)上述步驟,一共進行6次洗脫,各取上清液2 mL,測定總糖和蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        1.4.2鹽酸法脫蛋白

        根據(jù)準(zhǔn)確配制好的體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%、30% 6個梯度的鹽酸,與上述多糖溶液按1∶1(V/V)比例混合,充分混勻后,震蕩,靜置過夜,然后轉(zhuǎn)速3 500 r/min下離心5 min,取上清液2 mL,測定總糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        1.4.3三氯乙酸法脫蛋白

        精確稱取0.1 、0.3、0.5 、0.7 、0.9 、1.1 g的三氯乙酸,放入10 mL容量瓶中,加水定容,準(zhǔn)確配成質(zhì)量濃度0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.11 g/mL 6個梯度的TCA溶液,分別與鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物多糖溶液按1∶1(V/V)比例混合,震蕩混勻后,靜置過夜,離心機3 500 r/min離心5 min,取上清液2 mL,計算其總糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        1.4.4木瓜蛋白酶法脫蛋白

        吸取已準(zhǔn)確配好的0.01 g/mL多糖溶液2 mL于離心管中,加入一定量的木瓜蛋白酶,水浴酶解,待反應(yīng)完全后置于水浴鍋中沸水浴,酶滅活5 min,離心機3 500 r/min,離心5 min,取上清液2 mL,計算其糖和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

        選取反應(yīng)時間(A)、反應(yīng)溫度(B)和木瓜蛋白酶用量(C)為主要因素,通過單因素實驗得出水平取值,見表2。

        表2  L9(33)正交實驗因素水平表

        2結(jié)果與討論

        2.1多糖提取優(yōu)化結(jié)果

        根據(jù)提取溫度、提取時間和料液比3個因素的水平取值做L9(33)正交實驗,結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

        表3 正交實驗方案與結(jié)果

        表4 方差分析結(jié)果

        由正交實驗結(jié)果可知,對石斛原球莖培養(yǎng)物中多糖提取影響大小為:提取時間大于提取溫度大于料液比,最佳提取工藝條件為提取溫度90 ℃、提取時間60 min、料液比1∶40(g/mL)。F檢驗結(jié)果表明,反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和酶含量在所考察的范圍內(nèi)均不顯著(表3)。根據(jù)優(yōu)化得到的最佳提取工藝進行3次平行實驗,結(jié)果測得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為78.51 %,高于各單因素和正交設(shè)計實驗結(jié)果,因此所確定的最優(yōu)提取工藝條件合理可行。

        2.2Sevage法脫蛋白優(yōu)化結(jié)果

        用紫外分光光度儀在620 nm下測吸光度值,確定多糖含量,在595 nm下測吸光度值,確定蛋白質(zhì)含量。結(jié)果見圖1。

        由圖1可知,Sevage法脫蛋白一共洗脫6次,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)先升高后降低,隨著洗脫次數(shù)的增加,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)也一直在升高,但第六次開始下降。第五次洗脫時,測定的鐵皮石斛培養(yǎng)物中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,為43.81 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.67 %,效果最佳。

        圖1 不同洗脫次數(shù)對多糖及蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Impact of different elution times on polysaccharide and protein content

        2.3鹽酸法脫蛋白優(yōu)化結(jié)果

        蒽酮-硫酸法測多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù),考馬斯亮藍法測蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)(見圖2)。由圖2可知,隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的提高,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著鹽酸體積分?jǐn)?shù)的增加先升高后降低,而蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)一直呈降低趨勢,鹽酸體積分?jǐn)?shù)為25 %時,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為52.17 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4.82 %,效果最佳。

        2.4三氯乙酸(TCA)法脫蛋白優(yōu)化結(jié)果

        據(jù)圖3可知,隨著三氯乙酸TCA質(zhì)量濃度的升高,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈降低趨勢,多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后減少,TCA質(zhì)量濃度為0.03 g/mL時,測定的鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為35.50 %,蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.34 %,效果較好。

        圖2 不同體積分?jǐn)?shù)鹽酸對多糖及蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Impact of different HCL concentrations on polysaccharide and protein content

        圖3 不同濃度TCA對多糖及蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3Impact of different TCA concentrations on polysaccharide and protein content

        2.5木瓜蛋白酶法脫蛋白優(yōu)化結(jié)果

        根據(jù)反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度和木瓜蛋白酶用量3個因素的水平取值做L9(33)正交實驗,結(jié)果見表5,方差分析結(jié)果見表6。

        表5 正交實驗方案與結(jié)果

        表6 方差分析結(jié)果

        由正交實驗結(jié)果可知,對鐵皮石斛原球莖培養(yǎng)物多糖脫蛋白影響大小為酶含量大于反應(yīng)溫度大于反應(yīng)時間,最佳脫蛋白工藝條件為反應(yīng)時間90 min,溫度70 ℃、酶含量30 U。F檢驗結(jié)果表明,反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間和酶含量在所考察的范圍內(nèi)均不顯著(表6)。根據(jù)優(yōu)化得到的最佳提取工藝進行3次平行實驗,結(jié)果測得多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.01 %,高于各單因素和正交設(shè)計實驗結(jié)果,同時蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.89 %,最佳工藝條件合理可行。

        3結(jié)論

        實驗結(jié)果顯示,不同因素對提取率均有影響,以多糖得率為指標(biāo),確定最佳提取工藝條件為提取時間60 min、提取溫度90 ℃、料液比1:40(g/mL)。通過一系列的單因素實驗和正交優(yōu)化實驗,分析比較Sevag法、鹽酸法、三氯乙酸法和木瓜蛋白酶法4種脫蛋白工藝。結(jié)果表明,Sevag法脫蛋白操作繁瑣,步驟冗雜;酸法脫蛋白效果較好,但是鹽酸污染嚴(yán)重;三氯乙酸法脫蛋白多糖損失較為嚴(yán)重;木瓜蛋白酶法脫蛋白效果比較明顯,多糖損失較少,是一種較為理想的蛋白質(zhì)脫除方法。

        參考文獻:

        [1]張貝貝,劉文洪,李俊峰, 等.鐵皮石斛多糖對高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞Bax、Bcl-2表達的影響[J].中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(1): 64-70.

        [2]劉明昆, 李國慶. 石斛提取物抗腫瘤作用研究進展[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2015, 31(23): 3571-3574.

        [3]呂圭源, 顏美秋, 陳素紅. 鐵皮石斛功效相關(guān)藥理作用研究進展[J].中國中藥雜志, 2013, 38(4): 489-493

        [4]龔慶芳, 何金祥, 黃寧珍, 等. 鐵皮石斛花化學(xué)成分及抗氧化活性研究[J].食品科技, 2014, 39(12): 106-110.

        [5]吳人照, 楊兵勛, 李亞平. 鐵皮石斛多糖對SHR-sp大鼠抗高血壓中風(fēng)作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技, 2011, 18(3):204-205.

        [6]宋美芳, 李光, 陳曦, 等. 兩種石斛多糖提高小鼠免疫活性的初步研究[J].中國藥學(xué)雜志, 2013, 48(6): 428-431

        [7]李榕生, 楊欣, 何平, 等. 鐵皮石斛根莖中菲類化學(xué)成分分析[J].中藥材, 2009, 32(2): 220-223.

        [8]LI Y, WANG C L, WANG Y J, et al. Three new bibenzyl derivatives fromDendrobiumcandidum[J].Chem Pharm Bull, 2009, 57(2): 218-219.

        [9]王芳菲, 李燕, 董海玲, 等. 鐵皮石斛中一個新化合物[J].中國藥學(xué)雜志, 2010, 45(12): 898-902.

        [10]諸燕, 苑鶴, 李國棟, 等. 鐵皮石斛中11種金屬元素含量的研究[J].中國中藥雜志, 2011, 36(3): 356-360.

        [11]李娟, 李順祥, 黃丹,等.鐵皮石斛資源、化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].科技導(dǎo)報. 2011, 29(18): 74-79.

        [12]趙俊凌, 馬潔, 李戈,等. 齒瓣石斛多糖提取及脫蛋白工藝研究[J].時珍國醫(yī)國藥, 2010, 21(11): 2841-2843.

        DOI:10.3976/j.issn.1002-4026.2016.03.002

        收稿日期:2016-03-22

        基金項目:國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2014AA022201-05);山東省自然科學(xué)基金(ZR2014YL005)

        作者簡介:張英潔(1991-),女,碩士研究生,研究方向為天然產(chǎn)物分離純化。Email: 1009171097@qq.com *通訊作者,劉峰(1981-),男,博士,助理研究員,研究方向為天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。Email: liufeng8109@163.com

        中圖分類號:R284.2

        文獻標(biāo)識碼:A

        文章編號:1002-4026(2016)03-0007-06

        Extraction and deproteinization technology for polysaccharide fromDendrobiumofficinaleprotocorm

        ZHANG Ying-jie1,2, GENG Yan-ling2, WANG Xiao1,2, LIU Feng2*

        (1.School of Life Sciences, Shandong Normal University, Jinan 250014,China;2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Jinan 250014, China)

        Abstract∶We addressed polysaccharide extraction technology from Dendrobium officinale protocorm and compared different deproteinization methods. We conducted orthogonal experiments with extraction temperature and time, and the ratio of solid and liquid as parameters. We found its optimum extraction conditions included extraction temperature of 90 ℃,extraction time of 60 minutes and solid/ liquid ratio of 1∶40 (g/mL), and extraction efficiency could reach 78.51 %. We further compared Sevage, hydrochloricacid (HCl), trichloroacetic acid (TCA) and papain deproteinization technologies through a series of single element experiments and orthogonal optimization experiments. Experimental results show that: the fifth elution effect of Sevage is optimal, polysaccharide content of 43.81% and protein content of 9.67%. Elution effect is optimal, polysaccharide content of 52.17% and protein content of 4.82%, when HCL concentration is 25%. When TCA concentration is 0.03 g/mL, polysaccharide content is 35.50 % and protein content is 7.34 %. For papain method, optimum extraction conditions are enzymolysis time of 90 min, temperature of 70 ℃, and enzyme content of 30 U. The corresponding best effect is polysaccharide content of 85.01% and protein content of 5.89%.

        Key words∶Dendrobium officinale; polysaccharide; extraction; deproteinization

        【中藥與天然活性產(chǎn)物】

        猜你喜歡
        鐵皮石斛提取多糖
        米胚多糖的組成及抗氧化性研究
        熟三七多糖提取工藝的優(yōu)化
        中成藥(2018年3期)2018-05-07 13:34:45
        基于物聯(lián)網(wǎng)的鐵皮石斛仿野生高品質(zhì)栽培關(guān)鍵技術(shù)
        土壤樣品中農(nóng)藥殘留前處理方法的研究進展
        中學(xué)生開展DNA“細”提取的實踐初探
        淺析城市老街巷景觀本土設(shè)計元素的提取與置換
        蝦蛄殼中甲殼素的提取工藝探究
        科技視界(2016年22期)2016-10-18 17:02:00
        昆明地區(qū)鐵皮石斛人工栽培模式的發(fā)展和思考
        鐵皮石斛人工栽培模式
        酶法降解白及粗多糖
        中成藥(2014年11期)2014-02-28 22:29:50
        人妻系列少妇极品熟妇| 超薄肉色丝袜一区二区| 亚洲国产精品久久久天堂不卡海量| 日本熟妇高潮爽视频在线观看| 色yeye在线观看| 国产一区二区三区在线影院| 精品无码一区二区三区的天堂| 无套内射无矿码免费看黄| 国产成人亚洲综合无码精品| 亚洲精品女同在线观看| 91九色老熟女免费资源| 婷婷五月六月综合缴情| 亚洲AV无码精品色欲av| 国产视频一区二区三区免费| 天堂资源中文网| 国产精品久久久久久久免费看 | 性高朝大尺度少妇大屁股| 老师脱了内裤让我进去| 天美麻花果冻视频大全英文版 | 日韩成人极品在线内射3p蜜臀| 久久精品国产亚洲综合色| 亚洲av永久久无久之码精| 那有一级内射黄片可以免费看 | 尤物AV无码色AV无码麻豆| 久久久人妻一区二区三区蜜桃d| 国产精品综合色区在线观看| 97超级碰碰人妻中文字幕| 亚洲高清美女久久av| 国产变态av一区二区三区调教| 又粗又粗又黄又硬又深色的| 中文字幕一区二区三区四区在线 | 国产精品国产三级国产专播下| 首页 综合国产 亚洲 丝袜| 337p日本欧洲亚洲大胆色噜噜| 91久久精品国产性色tv| 户外精品一区二区三区| 四虎影视永久在线观看| 草草影院国产| 亚洲国产精品二区三区| 国产成人综合久久久久久| 男人靠女人免费视频网站|