蔡麗,劉毅,陸小青(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

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·動物實驗·

針刺對卒中后抑郁大鼠空間學習記憶功能及海馬CA3區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

蔡麗,劉毅,陸小青
(上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院,上海 200071)

【摘要】目的觀察針刺百會、印堂、四神聰穴對卒中后抑郁(PSD)模型大鼠空間學習記憶功能及海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)表達水平的影響。方法將30只成年雄性SD大鼠,按隨機數(shù)字表隨機分為對照組、針刺組及假手術組,每組10只。采用經(jīng)典的線栓大腦中動脈阻塞(MCAO)法加用慢性不可預見溫和應激(CUMS)結合孤養(yǎng)建立大鼠PSD模型。于應激開始第14天開始,針刺組予以針刺干預,連續(xù)干預14 d。應激結束后1星期進行Morris水迷宮試驗,評價大鼠空間學習與記憶功能。水迷宮測試結束后用免疫組化法測定海馬CA3區(qū)BDNF的表達。結果與假手術組比較,對照組大鼠學習能力顯著下降(P＜0.05),反映記憶功能的空間探索時間和跨平臺次數(shù)均顯著降低,分別是(22.36±6.20)s與(48.73±5.40)s、(3.72±0.90)次與(8.60±1.10)次,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。PSD大鼠經(jīng)針刺治療后,與對照組比較,學習能力及空間探索時間和跨平臺次數(shù)、BDNF表達均顯著提高,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。結論針刺治療可改善卒中后抑郁大鼠的空間學習記憶功能,提高卒中后抑郁大鼠模型海馬區(qū)BDNF水平。

【關鍵詞】針刺;中風并發(fā)癥;抑郁癥;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;記憶障礙;大鼠

卒中后抑郁(post-stroke depression,PSD)是腦卒中后最常見的神經(jīng)精神并發(fā)癥,可嚴重影響腦卒中患者神經(jīng)功能、認知功能及日常生活能力,成為影響患者功能恢復和卒中復發(fā)的獨立危險因素[1-2]。近年來,腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)在應激所致學習記憶損傷機制中的作用愈來愈引起人們的重視。BDNF主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達,不僅對神經(jīng)元的生存、生長、分化有重要的影響,而且還能增強突觸聯(lián)系,影響神經(jīng)元的可塑性,與學習記憶有關[3]。前期研究發(fā)現(xiàn),針刺治療可以改善卒中后抑郁患者的抑郁狀況,提高卒中后抑郁大鼠模型皮質(zhì)區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平[4-5]。本研究旨在通過建立PSD動物模型,予以針刺干預,進一步探討針刺治療對PSD模型大鼠空間學習記憶功能及海馬CA3區(qū)BDNF表達變化的關系,為研究針刺治療PSD學習記憶障礙的分子機制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1實驗動物

清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠36 只,3月齡,體重(220±20)g,上海實驗動物研究中心提供。所有大鼠分籠喂養(yǎng)于循環(huán)房內(nèi),溫度(23±2)℃,濕度60%,光/暗周期為12/l2 h,適應飼養(yǎng)1星期,自由攝食、飲水。每日逐只撫摸捉拿大鼠,使其適應實驗人員的操作。其間進行蔗糖水消耗訓練,1星期后進行曠場試驗行為評分,測定蔗糖水消耗和曠場試驗基線值。

1.1.2儀器與試劑

Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司XR-XM101),恒溫浴槽(XR-XM101-D2)、日本OLYMPUS攝影顯微鏡(CH型)、moticam 3000顯微攝影成像系統(tǒng)、電熱吹風機、兔抗BDNF多克隆抗體、BDNF免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),10%水合氯醛、4%多聚甲醛溶液等。

1.2實驗方法

1.2.1造模方法

采用經(jīng)典的線栓法大腦中動脈阻塞手術(MCAO)建立腦缺血模型,加用慢性不可預見溫和應激(CUMS)結合孤養(yǎng),建立大鼠PSD模型。MCAO模型參照改良的Koizumi方法建立[6]。術后24 h按Longa EZ等[7]標準行神經(jīng)功能評分。CUMS在MCAO術后7 d開始(神經(jīng)功能缺損已基本恢復),按Willner P[8]和Katz RJ方法[9]略改進,將①禁食、禁水20 h;②禁水17 h;③傾斜鼠籠(45℃)17 h;④持續(xù)光照17 h;⑤濕籠(100 g鋸屑加200 mL水)21 h;⑥4℃水中游泳5 min;⑦水平搖晃5 min;⑧行為限制2 h;⑨夾尾1 min;共9種刺激每天隨機采取1種,共安排21 d。孤養(yǎng),即單籠飼養(yǎng)[10]。用蔗糖水消耗試驗評價抑郁模型的可靠程度[11]。

1.2.2動物分組與處理

選取測定蔗糖水消耗量相近的大鼠30只,按照SPSS13.0生成隨機數(shù)字表,隨機分為對照組、針刺組和假手術組,每組10只。對照組和針刺組大鼠予以線栓法大腦中動脈阻塞加用慢性不可預見溫和應激結合孤養(yǎng)處理,假手術組大鼠接受相同手術流程,但不插入線栓,不進行應激和孤養(yǎng)處理,旨在排除手術對大鼠抑郁狀態(tài)的影響。

1.2.3干預方法

應激開始第14天開始對針刺組大鼠予以針刺干預,參照大鼠腦立體定位圖譜[12],采用前囟定位,采用《實驗針灸學》[13]中有關大鼠穴位定位方法,針刺大鼠百會、印堂、四神聰穴。使用0.30 mm×13 mm毫針(華佗牌,蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)針刺治療。百會、印堂、四神聰均為斜刺,深度均為0.2～0.3 mm,每次留針30 min,每隔10 min行針1次,每天1次,連續(xù)干預14 d。

1.2.4Morris水迷宮測試

測試在應激干預結束后1星期參照相關文獻[14]進行,包括定位航行實驗及空間探索實驗兩部分,其中定位航行實驗用于測試學習功能,空間探索實驗用于測試記憶功能。

定位航行實驗通過觀測大鼠的逃避潛伏期來檢測其學習記憶能力,即從入水到找到并爬上平臺所需時間。前5 d進行定位航行訓練,將大鼠分別從不同象限頭面向池壁投入水中,計算機自動跟蹤并分析大鼠尋找平臺的潛伏期,如果120 s仍未找到平臺,則人為引到平臺并停留30 s,此時逃避潛伏期記錄為120 s。每只動物每天訓練4次(分別從不同的象限入水),每次訓練之間間隔10 min,連續(xù)訓練5 d,將每天記錄的4次逃避潛伏期取平均值,作為大鼠當天的學習指標。5 d訓練結束后撤除平臺,在水池第三象限周邊壁上做明顯標記(黑色三角),開始空間探索實驗。將大鼠放入任一象限,分析60 s內(nèi)大鼠在平臺所在象限的停留時間(空間探索時間)和跨平臺次數(shù),作為記憶能力的評價指標。

每次訓練之間和4次訓練完成后,迅速將大鼠洗凈擦干,用吹風機吹干,以防大鼠低體溫。訓練結束后清洗游泳路線及側壁以消除嗅覺對測試的影響。

1.2.5海馬組織處理及海馬CA3區(qū)BDNF檢測

水迷宮實驗結束后,大鼠用10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉,置于木板平臺上,打開胸腔,生理鹽水心臟灌流。取腦組織放入4%多聚甲醛溶液中固定6 h,再置入30%蔗糖溶液中,待組織下沉時取海馬組織石蠟包埋。常溫下連續(xù)經(jīng)海馬矢狀切片,片厚5mm,每6張切片選一張用以研究,用鏈霉素抗生物素蛋白生物素復合物法(strept-avidin-biotin complex,SABC)行BDNF組織化學染色,免疫組化染色法按試劑盒說明書操作步驟進行。每張切片400倍鏡下攝片,每組取不連續(xù)10個視野的均值,顯微鏡觀察陽性細胞計數(shù)并攝片,借助圖像分析軟件Simple PCI(V5.2,compix Inc德國)進行定量分析。陽性表達在神經(jīng)元細胞胞質(zhì)中,膠質(zhì)細胞有部分表達,呈黃色或棕色。

1.3統(tǒng)計學方法

用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗,多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,差別以P＜0.05為有統(tǒng)計學意義,P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2　結果

本實驗中由于意外等原因,對照組與針刺組各死亡1只大鼠。

2.1各組大鼠不同時期糖水消耗量比較

在應激第14天后,對照組、針刺組糖水消耗量較假手術組明顯下降,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在針刺干預第7天后,針刺組糖水消耗量較對照組有明顯增高,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明試驗建立的卒中后抑郁模型是有效的,經(jīng)過針刺治療干預,糖水消耗量的提高證明了針刺治療的有效性。詳見表1。

表1　各組大鼠不同時期糖水消耗量比較(±s,%)

表1　各組大鼠不同時期糖水消耗量比較(±s,%)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與對照組比較2)P＜0.01

組別　n　應激前　應激第6天　應激第14天(干預第1天)應激第21天(應激結束,干預第7天) 第28天(干預第14天)假手術組　10　85.74±12.31　82.16±11.85　86.17±10.12　84.54±12.28　87.32±13.35對照組　9　86.03±12.51　80.81±16.21　63.25±12.451)　52.36±13.14　44.77±15.78針刺組　9　86.68±13.25　79.67±14.38　64.38±13.121)　67.14±13.15　75.63±11.272)

2.2各組大鼠定位航行學習能力比較(逃避潛伏期比較)

自訓練第2天開始,對照組逃避潛伏期的時間明顯長于同時點的假手術組,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。而針刺組與對照組比較,逃避潛伏期的時間明顯短于同時點的對照組,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P ＜0.01)。結果表明卒中后抑郁影響大鼠的學習能力,而針刺干預可有效改善這一影響。詳見表2。

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)

表2　各組大鼠逃避潛伏期比較(±s,s)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與對照組比較2)P＜0.01

組別　n　第1天　第2天　第3天　第4天　第5天假手術組　10　103.23±8.30　91.16±7.80　65.18±6.40　42.53±7.20　21.30±6.70對照組　9　112.04±9.10　104.76±6.90　83.26±7.401)　72.38±8.20　52.77±7.601)針刺組　9　108.69±7.70　97.66±6.40　69.35±6.401)　51.13±8.10　30.33±7.202)

2.3各組大鼠空間搜索能力比較

3組大鼠間空間探索時間和跨平臺次數(shù)比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),對照組記憶功能受損最明顯。經(jīng)針刺干預治療后,針刺組大鼠的記憶功能顯著提高,與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。表明卒中后抑郁大鼠的記憶能力下降,而針刺干預治療可有效改善PSD大鼠的記憶能力。詳見表3。

表3　各組大鼠空間探索時間和跨平臺次數(shù)比較　(±s)

表3　各組大鼠空間探索時間和跨平臺次數(shù)比較　(±s)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與對照組比較2)P＜0.01

組別　n　空間探索時間(s)　跨平臺次數(shù)(n)假手術組　10　48.73±5.40　8.60±1.10對照組　9　22.36±6.20　3.72±0.901)針刺組　9　36.59±5.70　6.96±1.302)

2.4各組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF表達水平比較

3組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF陽性細胞數(shù)比較差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01),對照組陽性細胞數(shù)最少,針刺組較對照組有所提高。詳見表4。

表4　各組大鼠海馬CA3區(qū)BDNF陽性細胞數(shù)比較(±s,個)

注:與假手術組比較1)P＜0.01;與對照組比較2)P＜0.01

組別　n　陽性細胞數(shù)假手術組　10　68.20±6.50對照組　9　40.50±5.801)針刺組　9　59.60±7.102)

2.5各組大鼠BDNF免疫組織化學染色結果

海馬區(qū)BDNF免疫組化陽性反映在神經(jīng)元細胞胞質(zhì)中,膠質(zhì)細胞有部分表達,呈黃色或棕色。從結果看,對照組BDNF水平明顯低于假手術組(P＜0.01),而針刺組明顯高于對照組(P＜0.01),說明針刺治療可促進BDNF的表達水平。詳見圖1。

圖1　各組大鼠海馬區(qū)BDNF免疫組化染色結果(?400)

3　討論

卒中后抑郁是指卒中后出現(xiàn)的以情緒低落、興趣減退、消極悲觀、易激惹、淡漠、失眠、焦慮,甚至出現(xiàn)自殺傾向為主要表現(xiàn)的病癥,是卒中常見并發(fā)癥之一,嚴重影響患者的認知功能和學習記憶水平[15-17]。中醫(yī)學認為其病位在腦竅,肝腎虧虛、氣郁痰阻為其基本病機[18-20],所以PSD的治療當醒腦開竅解郁為主[21-24]。百會穴位居顛頂部,其深處即為腦之所在,為督脈經(jīng)穴,督脈又歸屬與腦。根據(jù)《靈樞·衛(wèi)氣》理論,“頭氣有街”“氣在頭者,止之于腦”“腦為髓海”,百會為調(diào)節(jié)大腦功能的要穴[25-27]。印堂、四神聰均為經(jīng)外奇穴,有寧心安神、醒腦開竅的作用[28-31]。前期研究顯示[5],針刺百會、印堂、四神聰穴可以改善PSD患者的抑郁狀況,提高PSD大鼠模型皮質(zhì)區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平,為針刺治療PSD可能與調(diào)節(jié)皮質(zhì)區(qū)單胺類遞質(zhì)平衡提供了實驗室依據(jù)。BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)家族的重要一員,廣泛分布于成年哺乳動物和人體的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng),主要由海馬和大腦皮質(zhì)合成,對神經(jīng)元的存活、分化及損傷后修復方面發(fā)揮重要作用,可促進海馬神經(jīng)再生,逆轉突觸丟失,改善細胞信號轉導,恢復學習與記憶功能。從本實驗結果分析,對照組和針刺組較假手術組,逃避潛伏期時間增長、停留時間(空間探索時間)和跨平臺次數(shù)減小,表明卒中后抑郁影響大鼠的學習記憶能力。針刺組糖水消耗量較對照組明顯增高,逃避潛伏期的時間明顯縮短,空間探索時間和跨平臺次數(shù)增多,表明針刺干預可有效改善抑郁對學習記憶能力的影響。從海馬CA3區(qū)BDNF檢測結果分析,對照組BDNF陽性細胞數(shù)和表達水平明顯低于假手術組,而針刺組明顯高于對照組,說明針刺治療可促進BDNF的表達水平,改善抑郁癥狀。

因此,我們認為腦卒中抑郁可導致空間學習記憶能力下降,針刺治療可以改善PSD大鼠學習空間記憶功能,這可能與針刺可以提高大腦海馬區(qū)BDNF水平有關,但有關機制有待進一步深入研究。

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【中圖分類號】R2-03

【文獻標志碼】A

DOI:10.13460/j.issn.1005-0957.2016.04.0462

文章編號:1005-0957(2016)04-0462-04

收稿日期2015-07-20

基金項目:上海市教委預算內(nèi)項目(2012JW60);上海市青年醫(yī)師培養(yǎng)項目;上海市中醫(yī)醫(yī)院優(yōu)青項目

作者簡介:蔡麗(1984-),女,主治醫(yī)師,碩士,Email:cailiys@163.com

Effect of Acupuncture on Spatial Learning and Memory Abilities and Hippocampal CA3 Regional BDNF in Rats with

Post-stroke Depression

CAI Li,LIU Yi,LU Xiao-qing.
Shanghai University of Traditional Chinese Medicine Municipal Hospital

of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200071,China

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of acupuncture at points Baihui(GV20),Yintang(Ex-HN3)and Sishencong (Ex-HN1)on spatial learning and memory abilities and hippocampal expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in a rat model of post-stroke depression(PSD).MethodThirty male adult SD rats were allocated,using a random number table,tocontrol, acupuncture and sham operation groups,10 rats each.A rat model of PSD was made by classical middle cerebral artery occlusion (MCAO)using an intraluminal thread technique,chronic unpredictable mild stress(CUMS)and solitary feeding.At the fourteenth day after the beginning of stress,the acupuncture group received acupuncture intervention for 14 consecutive days.At one week after the end of stress,the Morris water maze test was conducted to assess rat spatial learning and memory abilities.After the completion of the water maze test,hippocampal CA3 regional BDNF expression was determined by immunohistochemical method. ResultRat learning and memory abilities decreased significantly in the control group compared with the sham operation group(P ＜0.05).Space exploration time and the number of crossing platform reflecting memory abilities decreased significantly in the control group(22.36±6.20 s and 3.72±0.90 times,respectively)compared with the sham operation group(48.73±5.40 s and 8.60±1.10 times,respectively);there were statistically significant differences(P＜0.01).Learning abilities,space exploration time, the number of crossing platform and BDNF expression increased significantly in PSD rats treated with acupuncture compared with the control group;there were statistically significant differences(P＜0.01).ConclusionAcupuncture can improve spatial learning and memory abilities and raise hippocampal regional BDNF levels in rats with post-stroke depression.

[Key words]Acupuncture;Stroke complications;Depression;Brain-derived neurotrophic factor;Dysmnesia;Rats?