耿西林，海軍，鄭偉，張煜，張智勇，杜立學

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·經(jīng)驗交流·

乙酰輔酶A羧化酶通過參與上皮間質轉化促進肝癌轉移

耿西林，海軍，鄭偉，張煜，張智勇，杜立學

（陜西省人民醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710068）

［摘 要］目的 研究乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylas，ACC）在肝癌細胞侵襲與遷移過程中的調控作用與機制。方法 （1）用免疫組化方法，分析30例肝癌患者癌與癌周組織中的ACC表達，明確ACC在肝癌中表達是否發(fā)生異常改變。（2）siRNA干涉肝癌細胞中ACC表達后，用Transwell法檢測肝癌細胞的遷移與侵襲能力。（3）siRNA干涉肝癌細胞中ACC表達后，用qRT-PCR及Western blotting檢測肝癌細胞上皮間質轉化相關分子E-cadherin、ZO-1、N-cadherin與Vimentin表達。結果 （1）免疫組化結果證實，ACC在肝癌組織中表達顯著高于癌旁組織，癌組織中染色陽性率為93.3%（28/30），癌周組織中染色陽性率為40% （12/30）。（2）干預ACC表達后，肝癌細胞遷移和侵襲能力均下降。（3）干涉ACC表達后，肝癌細胞中由Snail介導的上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被抑制，具體表現(xiàn)為：干涉ACC表達后，上皮細胞標志分子E-cadherin和ZO-1表達上調，而間質細胞標志分子N-cadherin和Vimentin表達下調。結論 ACC在肝癌組織中高表達并通過參與細胞上皮間質轉化促進肝癌轉移。

［關鍵詞］乙酰輔酶A羧化酶；肝癌；轉移；上皮間質轉化

上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮來源腫瘤獲得惡性遷移和侵襲能力的最主要過程，在腫瘤轉移中發(fā)揮重要的促進作用［1-2］。乙酰輔酶A羧化酶（Acetyl-CoA Carboxylate，ACC）是催化脂肪酸合成代謝第一步反應的限速酶，催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，在甘油三酯、磷脂和膽固醇等脂類的合成中發(fā)揮關鍵的調控作用［3］。近年來，大量研究已證實腫瘤細胞內(nèi)脂類合成活性異常增強，促進腫瘤的發(fā)生與進展［4］。ACC被證實在多種腫瘤細胞中高表達，與腫瘤細胞周期與凋亡調控密切相關［5］。

ACC在肝癌中的相關研究證實，ACC能促進脂肪酸合成促進肝癌存活［6］。此外，ACC高表達的患者具有較差的預后，提示ACC可能與肝癌的侵襲和轉移相關［7］，但目前缺乏ACC在肝癌中表達及其在肝癌轉移中的作用研究。本研究旨在探討ACC在肝癌中的表達及其在調控肝癌轉移中的作用與機制。

1 材料和方法

1.1 肝癌細胞系與肝癌臨床組織標本

1.1.1 細胞系：人肝癌細胞系SMMC-7721來源于中科院上海細胞所，培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，細胞置于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

1.1.2 肝癌患者組織標本：共收集30例原發(fā)性肝癌患者癌與癌周組織標本，患者均為2010年1月到2010 年12月在我院做過肝癌根治性手術切除的患者，其中男21例，女9例。所有患者臨床資料完整，病理診斷明確，患者均在事先簽署了知情同意書，術中取得組織標本后，立即置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2 實驗方法和步驟

1.2.1 免疫組織化學染色：手術獲得癌與癌周組織標本后，用福爾馬林固定24 h，石蠟包埋并進行組織切片。切片分別經(jīng)二甲苯脫蠟與梯度酒精水化、檸檬酸熱修復、過氧化氫浸泡與封閉，而后加入ACC抗體（abcam，ab63531，1/200稀釋），于4 ℃孵育過夜，PBS洗滌（3次×5 min），加入二抗（KIT-9902，福州邁新），于28 ℃孵育20 min，PBS洗滌（3次× 5 min），用加強型DAB顯色液（DAB-2031，福州邁新）進行顯色，蘇木精對細胞核染色3 min，PBS洗滌（3 次×5 min）。最后，切片經(jīng)梯度酒精脫水及二甲苯透明后封片，顯微鏡下拍照并觀察結果。

1.2.2 siRNA干涉肝癌細胞中ACC表達：ACC干涉序列參考自文獻［8］。其中，si-1序列為：5′-gatgtgagcct gcggaata-3′，si-2序列為：5′-ccacttggctgagcgat tg-3′。干涉片段委托上海吉瑪公司合成。

以2×105個細胞/孔，將SMMC-7721細胞接種至6孔板中，置于37 ℃含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。siRNA轉染嚴格按照脂質體lip2000說明操作進行，首先將siRNA干涉片段和脂質體lip2000（invitrogen，11668-019）用無血清培養(yǎng)基稀釋，室溫靜置5 min，用移液器將稀釋好的脂質體加入稀釋好的干涉片段中，輕柔顛倒混勻，室溫放置25 min。將100 μL的含有脂質體與干涉片段的轉染液加入6孔板中，細胞常規(guī)培養(yǎng)5 h后更換新鮮培養(yǎng)液，轉染48 h后收集細胞，分別進行蛋白提取與Transwell遷移侵襲實驗。

1.2.3 qRT-PCR：按上步所述方法對ACC表達進行干預處理，提取細胞TotalRNA（OMEGA，R6834）并反轉錄為cDNA（TaKaRa，D2680A），RNA提取與反轉錄步驟均嚴格按說明書進行。委托華大基因公司合成E-cadherin，ZO-1，N-cadherin，Vimentin及內(nèi)參基因GAPDH的引物，E-cadherin序列為：5′-CGAGAGCTACACG TTCACGGC，GGGTGTCGAGGGAAAAATAGG-3′。ZO-1序列為：5′-CACGCAGTTACGAGCAAG，TGAAGGTATCAGCGGAGG-3′。N-cadherin序列為：5′-TTTGATGGAGGTCTCCTAACACC，ACGTTTAACACGTTGGAAATGTG-3′。Vimentin序列為：5′-GCCCTAGACGAACTGGGTC，GGCTGCAACTGCCTAATGAG-3′。GAPDH序列為：5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG，ACACC ATGTATTCCGGGTCAAT-3′。用△△Ct法計算各分子相對表達水平。

1.2.4 Western blotting：事先對SMMC-7721細胞進行ACC干涉處理48 h，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液（P0013B，碧云天）裂解并提取細胞總蛋白，BAC蛋白定量（P0009，碧云天）后加入商品化的2×loading buffer（2×/E270，上海博華）并在水中煮沸5 min，調整蛋白濃度并上樣電泳，電泳結束后將凝膠中蛋白轉移至PVDF膜（IPVH00010，Millipore）表面，5% BSA室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜孵育，PBS洗滌（3次×5 min），二抗（優(yōu)寧維，GA-15A）28 ℃孵育2 h，PBS洗滌（3次×5 min），最后用ECL發(fā)光系統(tǒng)（Millipore，WBKLS0500）進行圖像采集和結果分析。

1.2.5 侵襲遷移實驗：事先對SMMC-7721細胞進行ACC干涉處理48 h。侵襲實驗需提前用基質膠包被Transwell小室（遷移實驗不需要此步驟），向小室內(nèi)加入50 μL含BSA（10 g/L）的無血清培養(yǎng)基。將200 μL密度為2×105個/mL的細胞加入小室內(nèi)，小室底部加入500 μL含胎牛血清的培養(yǎng)基，最后將細胞置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，遷移實驗培養(yǎng)24 h，侵襲實驗培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結束后，用棉簽輕柔擦去小室膜上層細胞，酒精固定5 min，細胞用結晶紫染色，顯微鏡下拍照并計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件，組間差異比較采用單因素方差分析，將P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ACC在肝癌中高表達

免疫組化結果證實：ACC在28例肝癌癌組織中呈陽性染色，陽性率為93.3%（28/30），在12例肝癌癌周正常組織中呈陽性染色，陽性率為40%（12/30）。ACC在24例患者癌組織中表達高于癌周組織，在2例患者癌與癌周組織表達相當，在4例患者癌組織中表達低于癌周組織。

上述結果證實，ACC在肝癌組織中表達上調。圖1所示為ACC在肝癌患者癌及癌周組織中的免疫組化染色（染色定位于胞漿）結果。

腫瘤組織　癌周組織圖1 ACC在肝癌患者癌及癌周組織中免疫組織化學染色結果

2.2 干涉ACC抑制肝癌細胞上皮間質轉化

為研究肝癌細胞中ACC的功能，我們通過參考已有文獻設計并合成了2個靶向ACC不同位置的siRNA干涉片段，并對其干涉效率進行了鑒定，結果如圖2B所示。

我們在肝癌細胞系SMMC-7721中干涉ACC表達，分別用qRT-PCR及Western blotting檢測上皮細胞標志分子E-cadherin、ZO-1、N-cadherin和Vimentin表達，以研究ACC在肝癌細胞上皮間質轉化（EMT）中的作用。結果顯示，干涉SREBP1C表達后，上皮細胞標志分子E-cadherin和ZO-1在mRNA和蛋白兩個水平表達均升高，而間質細胞標志分子N-cadherin和Vimentin在mRNA和蛋白兩個水平表達均降低，結果見

圖2A（mRNA水平）與2B（蛋白水平）。

A：qRT-PCR檢測干涉SREBP1C后上皮間質標志分子的表達；B：Western blotting檢測干涉SREBP1C后上皮間質標志分子的水平圖2 干涉ACC對上皮間質轉化標志分子表達的影響

2.3 干涉ACC下調EMT關鍵調控因子Snail表達

Snail是調控EMT過程的重要轉錄因子，為研究ACC是否通過上調Snail促進肝癌EMT發(fā)生，我們在肝癌細胞系SMMC-7721中干涉ACC表達，分別用qRT-PCR 及Western blotting檢測Snail表達。結果顯示，干涉ACC表達后，Snail表達水平明顯降低，結果見圖3A（mRNA水平）和3B（蛋白水平）。

A：qRT-PCR檢測干涉ACC后Snail的表達；B：Western blotting檢測干涉ACC后Snail的表達圖3 干涉ACC對Snail表達的影響

2.4 ACC促進肝癌細胞的遷移和侵襲

干涉肝癌細胞系SMMC-7721中ACC表達，用Transwell小室檢測細胞遷移與侵襲能力。結果顯示，干涉ACC表達后，遷移和侵襲至小室膜底面的細胞數(shù)均明顯減少，結果如圖4A和4B所示。

圖4　干涉ACC對肝癌細胞遷移（A）與侵襲（B）的影響

3 討論

腫瘤發(fā)生伴有細胞代謝重編程的發(fā)生，糖酵解與脂肪酸合成活性增強是腫瘤細胞代謝兩大最重要的代謝改變［9］。大量合成的脂肪酸被用于腫瘤細胞結構性成分的合成，如合成磷脂用于細胞膜結構的形成，進而為細胞快速增殖提供必要的物質原料［10］。

ACC是催化脂肪酸合成第一步反應的關鍵酶，在脂類代謝調控中發(fā)揮關鍵的調控作用。有關ACC的以往研究主要集中于其在糖尿病與其他代謝性疾病中發(fā)揮作用。最近有研究證實，ACC在多種腫瘤中表達升高，抑制ACC能通過調控細胞周期與凋亡抑制腫瘤發(fā)生與進展［11］，目前，ACC被認為是腫瘤的潛在治療靶點［11-12］。研究證實，使用ACC抑制劑TOFA，可顯著抑制肺癌與結腸癌細胞中脂肪酸合成并誘導細胞發(fā)生凋亡［13］。

ACC在肝癌進展中的作用仍不十分清楚，以往僅有兩項ACC在肝癌中的研究。第一項研究證實，ACC基因多態(tài)性與患者術后生存密切相關［7］，提示其在肝癌轉移中發(fā)揮促進作用。第二項研究證實，ACC能促進肝癌細胞在代謝壓力下的存活［6］。然而，目前缺乏ACC在肝癌中表達及其在轉移中作用的研究。我們的研究首次在肝癌中證實：ACC在肝癌中表達上調；干涉ACC能抑制肝癌細胞細胞侵襲與遷移；進一步分子機制研究證實，ACC通過上調Snail表達，促進肝癌細胞發(fā)生上皮間質轉化，促進細胞侵襲與遷移，進而促進肝癌轉移。

本研究發(fā)現(xiàn)：ACC在肝癌中表達上調并通過促進Snail介導的EMT促進腫瘤轉移，將為以ACC為靶點的腫瘤治療提供新的理論支撐。本研究尚存在以下不足，需在今后研究中進一步加強：（1）肝癌中ACC表達與患者預后研究；（2）ACC對肝癌轉移的體內(nèi)實驗研究；（3）ACC介導的脂肪酸合成增強上調Snail及其下游EMT的機制研究。

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（本文編輯：魯翠濤）

［中圖分類號］R735.7

［文獻標識碼］A

Doi:10.11952/j.issn.1007-1954.2016.04.008

［收稿日期］2016-02-22

［第一作者簡介］耿西林（1981-），男，河南蘭考人，主治醫(yī)師，碩士。

［通訊作者簡介］杜立學，主任醫(yī)師，博士，E-mail：lixuedu_xa@163.com。

Acetyl-CoA carboxylase promotes metastasis of hepatocellular carcinoma cells by promoting epithelial-mesenchymal transition

GENG Xi-lin， HAI Jun， ZHENG Wei， ZHANG Yu， ZHANG Zhi-yong， DU Li-xue. Department of Hepatobiliary Surgery， Shaanxi Provincial People’s Hospital， Xi’an 710068，China

Abstractobjective To evaluate the role of Acetyl-CoA carboxylas （ACC） in regulating metastasis of hepatocellular carcinoma cells. Methods （1） Immunohistochemistry analysis was used to determine ACC expression in 30 hepatocellular carcinoma tumor tissues and paired adjacent non-tumor tissues. （2） Transwell assay was used to analyze the migration and invasion capability of HCC cells after knocking-down of ACC expression using siRNA. （3） Expressions of epithelial mesenchymal transition （EMT） markers E-cadherin， ZO-1， N-cadherin and Vimentin were detected in HCC cells by qRT-PCR and Western blotting after knocking-down of ACC expression using siRNA. Results （1） Compared with adjacent non-tumor tissues， ACC is over-expressed in hepatocellular carcinoma tumor tissues. The rate of ACC positive staining was 93.3% （28/30） in tumor tissues and 40.0% （12/30） in adjacent non-tumor tissues. （2） Knockdown of ACC suppressed the migration and invasion capability of HCC cells. （3） Knockdown of ACC repressed Snail-mediated epithelial-mesenchymal transition， as the expressions of epithelial markers of E-cadherin and ZO-1 were up-regulated and the expressions of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin were down-regulated in HCC cells. Conclusion ACC is over-expressed in human hepatocellular carcinoma and promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by promoting snail-mediated epithelial-mesenchymal transition.

Key wordsAcetyl-CoA carboxylase （ACC）； hepatocellular carcinoma； metastasis； epithelial-mesenchymal transition